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为探究细胞色素 P460（cyts P460）和 c′-β（cyts c′-β）结构与功能关系，研究人员开展研究，发现其结构决定功能，对酶设计和蛋白进化研究意义重大。
在神秘的微观生物世界里，氮循环对维持生态平衡起着至关重要的作用，而细胞色素在其中扮演着不可或缺的角色。细胞色素是一类含有血红素辅因子的蛋白质，广泛参与电子转移、细胞凋亡和酶促反应等多种生物过程。近年来，科学家发现了一类特殊的细胞色素，即细胞色素 P460（cyts P460）和细胞色素 c′-β（cyts c′-β），它们具有独特的结构和多样的功能，引起了科研人员的浓厚兴趣。
以往研究发现，cyts P460 和 cyts c′-β 这两类蛋白虽然在序列上同源性较低，但却有着高度相似的整体蛋白折叠结构，然而它们的功能却截然不同。cyts P460 能够催化羟胺（NH?OH）氧化为一氧化氮（NO）和 / 或一氧化二氮（N?O），而 cyts c′-β 则被认为在结合 NO 以减轻氧化应激方面发挥作用，类似于结构上不相关的 α 螺旋气体结合细胞色素（cyts c′-α）。但直到现在，关于这两类蛋白结构如何决定功能，以及它们在生物体内的具体作用机制等问题，仍然存在许多未解之谜。为了深入探索这些奥秘，来自英国埃塞克斯大学（University of Essex）、日本广岛大学（Hiroshima University）等多个研究机构的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry》上。
研究人员采用了多种关键技术方法。在结构研究方面，运用 X 射线晶体学技术解析蛋白的三维结构，直观呈现其分子架构；利用圆二色谱（CD）确定蛋白的二级结构特征 。在光谱学研究中，借助紫外 - 可见吸收光谱（UV-Vis）、共振拉曼光谱（RR）和电子顺磁共振光谱（EPR）等手段，分析蛋白的电子状态、配位环境以及与配体的相互作用。此外，通过定点突变技术改变蛋白中特定氨基酸残基，研究其对蛋白功能和结构的影响 。
细胞色素 P460 和 c′-β 的发现与进化
细胞色素 P460 最早于 1972 年被发现，当时在从欧洲亚硝化单胞菌（Nitrosomonas europaea）的提取物中，科研人员观察到一种具有特殊吸收峰的可溶性色素，因其在还原减去氧化的吸收光谱中，463nm 处有主要吸收峰，故而被命名为 P460（本文中称为 NeP460）。1994 年，在专性甲烷氧化菌荚膜甲基球菌（Methylococcus capsulatus）中又发现了另一种细胞色素 P460（McP460） 。细胞色素 c′-β 最初是在纯化 McP460 的过程中被识别出来的。通过序列分析发现，cyts c′-β 与其他已知的 cyts c′序列相似性极低，但与 cyts P460 存在较高的序列相似性，这表明它们之间可能存在进化关系。进一步的研究证实，cyts c′-β 是从 cyts P460 进化而来的，并且它们在不同的细菌中分布有所差异，这暗示着它们的功能可能与细菌所处的环境和代谢需求密切相关。
细胞色素 P460 和 c′-β 的结构特征
通过序列分析和圆二色谱数据可知，cyts P460 和 cyts c′-β 具有独特的 β - 折叠结构，这与之前研究的典型 α 螺旋结构的 cyts c′明显不同。X 射线晶体结构显示，它们的亚基折叠包含一个五链反平行扭曲的 II 型 β - 折叠，以及一些较小的 α 螺旋特征 。尽管整体折叠相似，但不同蛋白之间仍存在一些细微差异，例如部分蛋白的 C 末端 α - 螺旋存在与否、β - 折叠之间环的长度和结构等都有所不同。在血红素口袋方面，cyts P460 中催化活性的 NeP460 和 McP460 远端口袋含有许多极性和带电残基，而 NsP460 的远端口袋则相对疏水。cyts c′-β 中，McCP-β 和 TCP-β 的远端口袋主要为疏水残基，NeCP-β 的远端口袋则含有一个精氨酸侧链。这些结构差异与它们的功能密切相关。
细胞色素 P460 和 c′-β 的光谱学性质
cyts P460 和 cyts c′-β 在光谱学性质上存在显著差异。UV-Vis 吸收光谱显示，由于是否存在赖氨酸与血红素的交联，它们具有不同的吸收特征。例如，天然的 cyts c′-β 表现出典型的五配位高自旋（5cHS）血红素的吸收特征，而 cyts P460 由于赖氨酸 - 血红素交联，在 Fe2?和 Fe3?状态下的 Soret 吸收峰都发生了红移 。RR 光谱也表明，cyts P460 和 cyts c′-β 的振动模式不同，这反映了它们血红素环境的差异。EPR 光谱显示，它们在低温下的溶液中表现出与高自旋（HS）Fe3?血红素一致的参数，并且突变会影响 EPR 光谱特征，进一步证明了结构与电子状态之间的联系。
细胞色素 P460 和 c′-β 的配体结合反应
研究人员对 cyts P460 和 cyts c′-β 与配体的结合反应进行了深入研究。在 cyts P460 方面，与 NH?OH、NO、CO 等配体形成的复合物具有不同的光谱特征和结合常数。例如，Fe3?NeP460 在厌氧条件下与 NH?OH 形成稳定的复合物，其 Soret 吸收带约为 445nm 。与 NO 反应生成的 Fe3?NO（{FeNO}?）复合物具有独特的吸收峰，且不同突变体的结合常数存在差异。在 cyts c′-β 方面，McCP-β 能够快速结合和释放气体配体，其与 CO、NO 的结合速率常数较高，这归因于血红素辅因子靠近蛋白质表面以及远端口袋残基在气体结合时的结构变化较小 。此外，NeCP-β 由于其远端口袋的极性，除了能结合 CO 外，还能结合氰化物（CN?）。
细胞色素 P460 和 c′-β 的催化活性
cyts P460 能够催化 NH?OH 氧化，这一过程需要特定的结构特征，如赖氨酸 - 卟啉交联和质子接受羧酸盐。野生型 NeP460 在厌氧条件下，以 2,6 - 二氯酚靛酚（DCPIP）为氧化剂，表现出一定的氧化活性，而突变体的活性则会发生改变 。研究还发现，在不同的氧化条件下，cyts P460 氧化 NH?OH 的产物不同，有氧时会产生 NO、N?O 和少量亚硝酸盐，无氧时主要产物为 N?O。cyts c′-β 中的 NeCP-β 则表现出类似过氧化物酶的活性，能够与 H?O?反应形成高铁（Fe??）中间体，这是 cyts P460 所不具备的功能。
细胞色素 P460 中血红素 - 赖氨酸交联的形成机制
细胞色素 P460 中不寻常的赖氨酸与血红素的交联形成机制一直是研究的热点。研究表明，这种交联可以在有氧表达蛋白质时自发形成，可能是由于赖氨酸氮上的孤对电子与血红素的 π 体系相互作用 。通过在厌氧条件下表达 NeP460，研究人员得到了交联缺陷（CLD）的前体酶，该酶催化活性丧失，但用 peroxide 处理后可以恢复活性，这表明 peroxide 依赖的翻译后修饰参与了交联的形成。此外，远端口袋中的其他残基，如 Arg44 和 Phe41，也可能在交联形成过程中发挥重要作用。
综上所述，这项研究深入探讨了细胞色素 P460 和 c′-β 的结构、功能、光谱学性质、配体结合反应、催化活性以及血红素 - 赖氨酸交联的形成机制。研究结果揭示了这两类蛋白结构与功能之间的紧密联系，为理解生物体内氮循环过程中相关蛋白的作用机制提供了重要依据，也为从头设计酶以及研究蛋白质进化提供了新的思路和方向。未来，研究人员可以进一步通过定点突变、光谱学和动力学研究，深入探究这些蛋白的精细结构与功能关系，为生物技术和生物医学领域的应用奠定基础。
