海洋生物发酵中 pH 调控与缓冲液选择的关键研究：以 Serratia rubidaea 产灵菌红素为例

为解决海洋生物发酵中 pH 控制及缓冲液选择问题，研究不同缓冲液对 Serratia rubidaea 产灵菌红素影响，发现 Good’s 缓冲液效果好，为生物工艺开发提供依据。

　　在神秘的海洋世界里，微生物就像一群隐藏的 “小精灵”，它们的生长和生存受到多种因素的影响，其中 pH 值的变化至关重要。在海洋生物的 “小天地” 里，自然的地球化学循环以及微生物群落对其的响应，会让局部区域的质子浓度发生变化，形成一个个小小的 “pH 梯度”。这就好比是微生物们生活的 “酸碱环境” 在不断变化，而这个变化对微生物的生长、生存以及它们产生的各种物质都有着深远的影响。

在海洋生物的发酵过程中，精确控制 pH 值就如同给微生物们打造一个舒适的 “家”，是极其重要的。然而，在实验室常用的摇瓶发酵中，除了培养基中缓冲液的微弱作用外，通常没有其他的 pH 控制手段。传统的磷酸盐缓冲液虽然常见，但它就像一个 “小麻烦”，会和培养基中的其他成分发生反应，导致沉淀产生，影响微生物的生长和产物的生成。比如，它可能会和海水中常见的钙离子（Ca²⁺）、镁离子（Mg²⁺）结合，使这些对微生物至关重要的离子变得难以被利用，还会干扰许多依赖金属离子的生化反应。因此，寻找一种更合适的缓冲液来替代磷酸盐缓冲液，成为了科研人员亟待解决的问题。

为了攻克这个难题，来自葡萄牙里斯本大学高等技术学院生物工程系 iBB - 生物工程和生物科学研究所的 Ricardo F. S. Pereira 和 Carla C. C. R. de Carvalho 展开了深入研究。他们以从大西洋浅海热液喷口分离出的 Serratia rubidaea 菌株为研究对象，该菌株能够产生具有抗菌和抗癌特性的灵菌红素（Prodigiosin）。他们的研究成果发表在《Marine Biotechnology》上，为海洋生物发酵工艺的优化提供了重要的理论依据和实践指导。

在这项研究中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是脂质组学分析，通过这种方法可以深入了解细胞在不同条件下细胞膜脂肪酸的组成变化，就像是给细胞的 “膜结构” 做了一次精细的 “体检”；其次是多元统计分析，它能帮助研究人员从复杂的数据中找出规律，分析不同缓冲液和 pH 值对细胞生长、灵菌红素生产以及细胞膜脂肪酸组成的影响，就像是给杂乱无章的数据找到了 “秩序”。

下面来看看具体的研究结果：

1. 磷酸盐缓冲液对培养基、细菌生长和灵菌红素生产的影响：研究人员发现，用含有 Na₂HPO₄/KH₂PO₄的磷酸盐缓冲液制备培养基时，在 pH 值 7.0 - 8.0 的范围内，灭菌前培养基的浊度就比对照组高，这意味着有成分开始沉淀了。而经过灭菌后，缓冲液培养基的浊度更是大幅增加，而且随着 pH 值升高，浊度增加得越明显。进一步研究发现，磷酸盐缓冲液会诱导培养基中的化合物沉淀，这直接导致了灵菌红素的产量下降。与未添加缓冲液的培养基相比，添加磷酸盐缓冲液后，灵菌红素的产量降低了 2.5 - 6.8 倍，不过在 pH 值 8.0 时产量相对较高，但仍比不上未添加缓冲液的情况。
2. 非磷酸盐缓冲液对细菌生长和灵菌红素生产的影响：为了解决磷酸盐缓冲液带来的问题，研究人员尝试了几种 Good’s 缓冲液。结果发现，这些缓冲液在一定程度上提高了生物量产量，不过在 pH 值低于 7 时，磷酸盐缓冲液下的生物量产量比使用 MES 和 HEPES 等 Good’s 缓冲液时更高。在灵菌红素生产方面，不同 pH 值下的表现差异很大。在 pH 值低于 7.0 时，使用 MES 缓冲液能使灵菌红素产量显著增加，在 pH 5.5 时达到 249.8mg/L，相比未添加缓冲液的对照组提高了 49.5 倍。但在 2 - L 生物反应器中进行实验时却发现，MES 缓冲液对 Serratia rubidaea 细胞产生了抑制作用，尤其是在灵菌红素生产方面，使产物与生物量的比率降低了 3.0 倍。这可能是因为 MES 是一种两性离子缓冲液，会竞争性抑制参与灵菌红素生物合成的金属 β - 内酰胺酶（metallo - β - lactamases）。
3. pH 7.0 缓冲液的选择：大多数酶在接近中性的 pH 值下催化活性最高，但从工业角度考虑，酸性 pH 值可能会腐蚀生物反应器的材料。因此，研究人员在 pH 7.0 的条件下比较了多种缓冲液对生物量和灵菌红素生产的影响。结果显示，使用 EPPS、HEPES 和 TRIS 缓冲液时，灵菌红素的浓度较高，分别达到 153.1mg/L、148.8mg/L 和 126.8mg/L 。不同缓冲液对灵菌红素生产的影响差异较大，这可能与缓冲液的化学结构以及它们与金属离子的相互作用有关。
4. pH 对细菌细胞膜影响的多元分析：脂质组学分析表明，Serratia rubidaea 细胞的适应性主要与 pH 值有关，而与缓冲液的类型关系较小。随着培养基 pH 值从 5.5 升高到 7.5，单不饱和脂肪酸（MUFA）的浓度增加，饱和环丙基支链脂肪酸（CycloFA）的浓度降低，这使得细胞膜的流动性增加。在酸性条件下，细胞会形成一种 “膜屏蔽效应”，通过增加 CycloFA 来降低细胞膜的流动性，从而提高膜的稳定性，减少质子的渗透。而随着 pH 值升高，细胞会增加 MUFA 的合成来维持膜的流动性，因为合成 MUFA 比合成 CycloFA 更节能。主成分分析（PCA）和偏最小二乘法（PLS）分析进一步证实，Serratia rubidaea 细胞会根据使用的缓冲液和培养基的 pH 值改变其脂肪酸组成，而且缓冲液的类型也会影响灵菌红素的生产。
5. 缓冲液类型对细菌细胞膜影响的多元分析：研究发现，在 pH 7.0 的培养基中，只有当使用 PIPES 和 MES 缓冲液时，Serratia rubidaea 细胞的脂质谱才会发生变化，导致灵菌红素产量降低。偏最小二乘法分析表明，不同类型的缓冲液会导致细胞脂肪酸组成的差异，进而影响灵菌红素的生产。例如，使用 EPPS 或 HEPES 缓冲液培养时，16:4 ω3c 脂肪酸对灵菌红素生产的贡献较大；使用 TRIS 和 MOPSO 缓冲液时，16:0 脂肪酸的贡献较大；使用 MES 和 PIPES 缓冲液时，16 和 18 碳原子的 MUFA 脂肪酸更为突出；使用磷酸盐缓冲液时，17:0 脂肪酸的贡献较大。

综合来看，这项研究通过对 Serratia rubidaea 产灵菌红素过程的研究，深入探讨了不同缓冲液和 pH 值对细胞生长、产物生成以及细胞膜脂肪酸组成的影响。研究结果表明，虽然磷酸盐缓冲液在海洋生物发酵中存在一些问题，但 Good’s 缓冲液是一种可行的替代方案。在不同的 pH 值条件下，Good’s 缓冲液对灵菌红素生产的影响各不相同，其中 MES 缓冲液在 pH 5.5 时能显著提高灵菌红素产量，但在生物反应器中可能会产生抑制作用。在 pH 7.0 时，EPPS、HEPES 和 TRIS 等缓冲液表现出较好的效果。此外，研究还发现，培养基的 pH 值对细胞膜脂质谱的影响比缓冲液种类更大，细胞会通过调整脂肪酸组成来适应环境变化。这些研究成果为海洋生物发酵工艺中缓冲液的选择和 pH 值的调控提供了重要的参考，有助于优化生物工艺，提高海洋微生物产物的生产效率，对于推动海洋生物产业的发展具有重要意义。