优化甘蔗茎薄壁细胞原生质体和液泡分离方案，解锁其代谢奥秘

为探究甘蔗茎溶酶液泡作用，研究人员优化其原生质体和液泡分离方案，提升产量、活力和纯度。

　　了解甘蔗茎溶酶液泡（lytic vacuoles）的生化和结构特性，对于揭示其在植物代谢和细胞内稳态中的作用至关重要。当前的研究主要聚焦于优化从成熟甘蔗茎薄壁细胞中分离原生质体（protoplasts）和液泡（vacuoles）的实验方案。成功分离液泡的一个前提条件是，通过合理的酶处理诱导细胞裂解，确保释放出高质量的原生质体。研究发现，利用酶浓度为 “D”（2.5% 纤维素酶 R - 10（Cellulase R - 10）和 0.6% 离析酶 R - 10（Macerozyme R - 10））的最佳条件，每克鲜重（FW）可产生 11.36×10⁴个原生质体，并且通过伊文思蓝（Evan’s blue）染色评估其最大活力。因此，研究得出 0.4M 甘露醇浓度、28°C 下酶解 5 小时是获得最大原生质体产量的有效条件。此外，通过基于菲可（Ficoll）密度梯度离心法进行的液泡纯化过程，能够产生完整且液泡膜（tonoplast）完整性高的液泡。利用对酸性区室具有特异性的中性红染色，以及在荧光显微镜下使用液泡膜特异性荧光染料 MDY - 64 对液泡组分进行观察，验证了这些结果。此外，通过液泡特异性标记酶 α - 甘露糖苷酶（α - mannosidase）活性检测，发现其富集倍数高达 43 倍，从而证实了液泡的纯度。对液泡组分进行的酶活性检测证实了交叉污染程度极低。同时，生化分析结果显示，液泡和原生质体之间的蔗糖、氨基酸、还原糖和蛋白质水平存在差异，这表明它们具有特定的代谢功能。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）分析结果显示，原生质体和液泡组分具有不同的蛋白质谱。这种优化后的原生质体和液泡分离方案，提高了产量、活力和纯度。