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研究人员为检测非参考转座子（TE）插入，开发 TEd-seq 技术，可同时检测多个 TE 家族插入，助力研究。
在神秘的基因组世界里，有一种神奇的 “小精灵”—— 转座子（Transposable elements，TE），它们能够在基因组中自由移动和复制。曾经，人们认为这些 “小精灵” 只是基因组中的 “寄生虫”，但现在大家逐渐意识到，它们在基因组的功能和结构进化中扮演着至关重要的角色。TE 的插入就像在基因组这个大拼图中放入新的碎片，可能会引起基因突变，进而影响生物的表型和进化。然而，由于 TE 的重复性质，利用传统的短读长测序技术很难在全基因组范围内对它们进行分析。而且，TE 的移动通常非常罕见，在小规模的群体研究中，新的 TE 插入很容易被遗漏。所以，能够在大规模群体中检测新的 TE 插入，对于研究转座活动及其对基因组功能和进化的影响至关重要。
为了攻克这些难题，法国植物科学研究所（Institute of Plant Sciences Paris-Saclay，IPS2）的研究人员 Pol Vendrell-Mir、Basile Leduque 和 Leandro Quadrana 开展了深入研究。他们的研究成果发表在《Genome Biology》杂志上。这项研究意义重大，它为我们打开了一扇了解基因组进化的新窗口，让我们能够更深入地探究 TE 在生物进化过程中所扮演的角色。
研究人员为了实现高效检测非参考 TE 插入，采用了多种关键技术方法。首先是 TEd-seq 测序技术，该技术基于经典的低通量转座子展示分析方法，并进行了关键改进，使其能够与高通量短读长和长读长测序技术兼容。在实验中，研究人员利用拟南芥（Arabidopsis thaliana）的 TE 积累（TEA）系，通过将不同 TEA 系的基因组 DNA（gDNA）稀释到野生型 Col-0 植物的 gDNA 中，构建了含有不同浓度非参考 TE 插入的混合样本。之后，使用 Oxford Nanopore Technologies（ONT）测序技术对 TEd-seq 文库进行测序，这种技术不仅能够测序长 DNA 片段，还具有便携性和实时生成测序数据的优势，大大缩短了从 DNA 提取到插入鉴定的时间。研究人员还开发了专门的生物信息学工具，用于分析测序数据，准确检测 TE 插入位点。
下面来看看具体的研究结果：
- TE 展示测序（TE display sequencing）：研究人员对经典的转座子展示分析方法进行优化，使用超声随机片段化代替酶切消化，设计了特殊的适配体，并通过巢式 PCR（Nested PCR）提高检测的灵敏度和特异性。同时，开发的生物信息学工具能够有效处理测序数据，检测 TE 插入位点。
- 高特异性和超灵敏地检测新的 TE 插入：利用拟南芥的 TEA 系，研究人员将含有不同浓度非参考 TE 插入的混合 gDNA 进行 TEd-seq 测序。结果显示，该方法能够检测到稀释至 1/6400 的 TE 插入，并且检测到的插入与稀释因子相关性良好。通过经验灵敏度和理论计算，研究人员发现 400M reads 足以检测到稀释至 1/250,000 的 TE 插入。
- 使用 ONT 测序灵敏检测 TE 插入：研究人员对 TEd-seq 文库进行 ONT 测序优化，结果表明，ONT 测序的平均读长比短读长测序更长，与金标准数据集相比，检测到的非参考 TE 插入具有 100% 的对应性。仅用 1M ONT reads 就能识别出 1/400 稀释样本中超过 70% 的插入，且灵敏度与约 1M 短读长相当。ONT 测序的便携性和短周转时间使得从 DNA 提取到插入鉴定的时间小于 24 小时。
- 使用多重 TEd-seq 同时检测多个 TE 家族的插入：研究人员设计了针对不同 TE 家族的引物，对多个 TE 家族进行同时检测。结果显示，多重 TEd-seq 能够检测到不同 TE 家族的插入，灵敏度约为 98%，总体准确率为 96.8%，这表明该方法能够同时研究多个 TE 家族，有助于探索复杂的 “移动基因组（mobilome）”。
- 多重 TEd-seq 助力进化与重测序（Evolve and resequencing，E&R）实验：研究人员利用多重 TEd-seq 对拟南芥的 E&R 实验进行研究，发现约 4% 的新 TE 插入受到正向或负向选择。此外，研究还揭示了 TE 插入的等位基因频率变化、转座率以及它们与基因功能的关系，为理解 TE 在进化中的作用提供了重要依据。
在研究结论与讨论部分，TEd-seq 技术展现出诸多优势，它具有高灵敏度、与短读长和长读长测序平台兼容、能够精确估计大规模群体中 TE 插入等位基因频率等特点。该技术还可以同时检测多个 TE 家族的插入，成本效益高，操作简单，通用性强。通过 TEd-seq 技术，研究人员在拟南芥的 E&R 实验中发现，大多数新的 TE 插入是中性或接近中性的，但仍有部分受到选择作用。这一结果与之前认为 TE 入侵会引发连锁反应的观点不同，表明自然选择可能会限制新 TE 插入的失控积累。然而，由于该 E&R 实验仅进行了两代，对受到反选择的 TE 插入的估计可能不足。未来，延长实验代数并在不同环境中重复实验，将有助于更精确地评估新 TE 插入突变的适应性效应。
总的来说，这项研究开发的 TEd-seq 技术为研究 TE 插入提供了一种强大的工具，不仅能够帮助我们深入了解基因组进化的机制，还有助于揭示 TE 在生物适应环境过程中的作用。这一成果为生命科学领域的研究开辟了新的方向，有望推动相关领域的进一步发展。
