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研究人员针对金银花（JYH）易被掺假问题，开展 Proofman-LMTIA 技术鉴别研究，该技术检测精准，对中药质量控制意义重大。
在中医药的世界里，金银花（Lonicera japonica Thunb.，简称 JYH）就像一颗璀璨的明珠，是传统中医常用的一味良药。它有着清热、解毒、疏散风热等功效，常用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒等病症。然而，市场上金银花的身影却并不 “纯粹”，常被价格较低的山银花（Shanyinhua，简称 SYH）冒充。山银花与金银花虽然同属忍冬属，但化学组成和药用功效存在差异，山银花中某些成分可能会引发不良反应，而金银花富含的绿原酸和木犀草素 - 7 - O - 葡萄糖苷等成分使其在清热、解毒方面功效更优。这种掺假行为不仅损害了消费者的利益，还威胁到了人们的健康。
目前，《中国药典》中规定的金银花鉴别方法，如形态学检查、显微镜鉴别、薄层色谱法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC）等，存在主观性强、需要专业设备和技术人员操作等问题。近年来，拉曼光谱结合深度学习、基于 ITS2 序列的 DNA 条形码等新技术虽有应用前景，但昂贵的设备和较长的检测时间限制了它们的推广。因此，寻找一种快速、经济、可靠且无需复杂设备的金银花鉴别方法迫在眉睫。
许昌学院食品安全生物标志物快速检测技术河南省重点实验室、化学与材料工程学院的研究人员，在王德国教授团队的带领下，开展了一项针对金银花鉴别的研究。他们运用 Proofman-LMTIA（Proofman 探针 - 阶梯熔解温度等温扩增）技术，为金银花的精准鉴别带来了新的曙光。该研究成果发表在《Scientific Reports》上。
研究人员开展此项研究时，用到了多种关键技术方法。首先是 DNA 提取技术，从不同的植物材料、药品和固体饮料样本中提取基因组 DNA，为后续实验提供物质基础。其次是基于 5.8S-ITS2 序列的引物设计技术，通过比对金银花和山银花的 5.8S-ITS2 序列差异，设计出特异性引物和 Proofman 探针。此外，还运用了等温扩增技术，即 Proofman-LMTIA 技术，在恒温条件下进行核酸扩增，实现对金银花的快速检测 。
研究结果如下：
- 5.8S-ITS2 rDNA 序列分析和引物设计：通过 DNAMAN7 软件对金银花和山银花的 5.8S-ITS2 rDNA 序列进行比对，发现了包括 99G/A、106 C/T 和 122 A/G 三个单核苷酸多态性（SNPs）位点的显著差异。基于这些差异位点，遵循 LMTIA 引物设计原则，成功设计出特异性引物和 Proofman 探针，这些引物能确保金银花的成功扩增 。
- 引物筛选：利用 SYBR Green I 荧光检测法对多组引物进行筛选，在不同温度下比较其对金银花质粒 pMD19T-LjDNA 的扩增效果。结果显示，F1 引物组在 58℃时扩增最早，在第 12 个循环就实现了显著扩增，因此被选择用于后续测试 。
- 温度优化：对 Proofman-LMTIA 反应温度进行优化，在 59℃ - 67℃范围内进行测试。结果表明，67℃时扩增最快，扩增循环从第 17 个循环开始，故将 67℃确定为最佳反应温度 。
- 特异性实验：以 10 ng/μL 的金银花质粒 pMD19T-LjDNA 为阳性对照，10 ng/μL 的山银花质粒 pMD19T-LmDNA 和灰毡毛忍冬（L. hypoglauca）的基因组 DNA 为阴性对照进行实验。结果显示，只有在金银花质粒 DNA 存在时才发生扩增，证明了该方法对金银花具有高度特异性 。
- 灵敏度实验：对金银花质粒 pMD19T-LjDNA 进行系列稀释，从 10 ng/μL 到 1 pg/μL 进行测试。结果表明，该方法在低至 10 pg/μL 的浓度下仍能可靠扩增，1 pg/μL 时无扩增，确定其灵敏度阈值为 10 pg/μL 。
- 检测限实验：制备不同比例的金银花和山银花质粒混合物进行检测，结果显示 Proofman-LMTIA 能成功检测出低至 1%（v/v）浓度的金银花，证明该方法的检测限为 1%（v/v） 。
- 市场样本检测：运用 Proofman-LMTIA 技术对 8 个市售金银花切片样本、6 种含金银花的药品和 1 种固体饮料进行检测。结果显示，所有样本均被准确鉴定，8 个金银花切片样本的检测阳性率达到 100%，含金银花的药品和固体饮料也均被证实含有金银花，验证了该方法在实际应用中的可靠性 。
研究结论与讨论部分指出，Proofman-LMTIA 技术是金银花分子鉴定领域的重大突破。与传统和先进的鉴定技术相比，它具有操作简单、成本低、检测快速、特异性高和灵敏度强等优势。该技术能够在 1 小时内完成基因组 DNA 提取和真伪鉴定，尤其适用于含有多种草药成分的高度加工中药产品的鉴定。然而，该技术也存在一定局限性，目前只能进行定性检测，无法确定样本中金银花的具体含量。未来研究可通过引入内参基因开发定量版本，同时进一步与便携式自动化平台集成，拓展其在现场检测的应用。此外，还可探索该技术的多重检测潜力，结合机器学习算法提高检测准确性，为中药行业质量控制提供更强大的支持。总之，Proofman-LMTIA 技术为保障金银花产品的质量和安全提供了有效手段，有望在中药行业得到广泛应用，推动中药质量控制体系的发展 。
