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本文成功用猪诱导多能干细胞（piPSCs）生成视网膜类器官（ROs），并与人类 ROs 进行对比，为视网膜研究提供新方向。
一、研究背景
视网膜光感受器（PR）退化导致的失明在全球范围内普遍存在。由于哺乳动物（包括人类）缺乏 PR 再生能力，因此需要通过替代或绕过 PR 来恢复视力。利用人类多能干细胞（hPSCs）在体外生成视网膜细胞和组织的技术，推动了多项临床试验的开展，主要集中于重建视网膜色素上皮（RPE）。同时，hPSCs 来源的视网膜类器官（ROs）移植试验也在进行中，ROs 包含 PR 以及神经视网膜中的所有主要细胞类型。
然而，hPSC - PR 替代试验相对较少，这不仅是因为临床 PR 制造的复杂性，还因为在临床前动物模型中使用人类 PR 异种移植来证明视力恢复存在挑战。神经元异种移植受到免疫不相容性和突触蛋白进化差异的限制，这可能会阻碍人类 PR 与非人类宿主视网膜中间神经元之间的功能连接。
猪作为一种理想的大型动物临床前模型，在眼部研究中具有重要价值。其眼睛的解剖和生理特征与人类相似，且猪和人类的视网膜在出生时发育和组织相似。此外，猪已被广泛用于创建人类视网膜退行性疾病（RDDs）或视网膜损伤的模型，用于测试实验性治疗的安全性和有效性，包括干细胞疗法。
自 2000 年代初以来，人们一直在努力生成猪诱导多能干细胞（piPSCs），但早期尝试存在诸多问题，如无法维持干细胞的关键特性、分化效率低等。尽管如此，研究人员从未放弃，不断探索新的方法和技术。近年来，随着猪 PSC 特异性培养基和无转基因 piPSCs 的开发，这些问题得到了一定程度的解决，使得猪细胞能够进行可重复的多谱系分化。然而，新一代 piPSCs 能否产生 ROs 仍有待研究。
二、研究方法
研究人员通过优化小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层密度，确保 piPSCs 的多能性得以维持。同时，对已有的人类 RO 分化方案进行修改，以适应猪的妊娠期较短的特点，从而建立了猪 iPSC - RO 分化方案。
利用免疫细胞化学（ICC）技术，对不同阶段 piPSC - ROs 中的视网膜细胞类型进行鉴定和分析。通过对固定的猪 ROs 冷冻切片进行免疫染色，使用针对不同神经视网膜细胞类型标记物的一抗，结合尼康 A1R 共聚焦显微镜成像，观察细胞的分布和特征。
采用单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）技术，对不同阶段的 piPSC - ROs 进行分析。制备猪 ROs 的单细胞悬液，按照 10× Genomics Chromium Next GEM 试剂的制造商指南进行 scRNA - seq。利用 Seurat R 包和 Scry R 包等进行数据处理，包括质量控制、归一化、选择可变特征、主成分分析、样本聚类和差异基因表达分析等。
三、研究结果
在优化的条件下，研究人员成功地利用 piPSCs 高效、可重复地生成了大量 ROs。通过调整分化方案的时间节点，如提前添加骨形态发生蛋白 4（BMP4）、提前转换培养基以及提前进行 ROs 的解剖和悬浮培养等，使得每个分化过程平均可产生 217 ± 19 个 ROs。在分化过程中，piPSC - ROs 保持了良好的形态，并且在后期出现了类似于人类 ROs 的 PR 外段样突起。
早期（d15 - d40）piPSC - ROs 主要由增殖性视网膜祖细胞（RPCs）、视网膜神经节细胞（RGCs）和早期锥 PR 组成。ICC 分析显示，d15 时，VSX2 + / Ki67 + 的 RPCs 分布在猪 ROs 的外神经母细胞层；d40 时，PHH3 + 的增殖细胞集中在外缘，OTX2 + 的 PR 前体遍布神经上皮，SNCG + 的 RGCs 位于内部，其突起向外延伸。scRNA - seq 分析进一步确认了这些细胞类型的存在，并表明 RGCs 和锥 PR 的分化程度高于 RPCs。
晚期（d118 - d122）piPSC - ROs 包含杆状和锥状 PR、Müller 胶质细胞（MG）、无长突细胞（ACs）和双极细胞（BPCs）。ICC 分析显示，d120 时，RHO + 的杆状 PR 和 GNAT2 + 的锥状 PR 位于组织良好的外核层（ONL），G0α + 的 BPCs 位于 ONL 下方的一层，CRALBP + 的 MG 细胞体位于内核层（INL），其突起穿过 ONL。scRNA - seq 分析鉴定出了这些细胞类型，并通过 Palantir 伪时间分析揭示了它们的分化状态。
随着时间的推移，piPSC - ROs 中 PR 的数量逐渐增加。早期 piPSC - ROs 主要由 RPCs 组成，而晚期则以杆状 PR 为主。比例分析和 sccomp 分析均表明，RO 细胞类型的组成在早期和晚期存在显著差异。通过 ICC 和流式细胞术分析发现，PRs 在 d40 - d120 期间逐渐迁移到 ROs 的外缘，形成密集的 ONL，且 PRs 的百分比显著增加。
成熟的 piPSC - ROs 在细胞组织上模仿了成年猪外视网膜的结构。在 d190 的 piPSC - ROs 中，M/L Opsin + 的锥状 PRs 位于 ONL 的最外层，其余部分由 RHO + 的杆状 PRs 组成。虽然与成年猪视网膜相比，piPSC - ROs 中的锥状 PRs 数量较少，且 M/L Opsin 和 RHO 的分布存在差异，但它们能够形成类似的分层结构，包括 ONL、外网状层（OPL）和 INL，并且锥状 PRs 具有典型的轴突终端，与 G0α + 的 BPCs 形成突触连接。
通过对 d120 piPSC - ROs 和 d205 人类胚胎 PSC - ROs 的 scRNA - seq 元分析，发现猪和人类 ROs 在发育上具有高度的转录组保守性。Seurat 映射预测显示，piPSC - ROs 中的多种视网膜细胞类型，尤其是 PRs 和 BPCs，与人类 ROs 中的对应细胞类型具有相似的分子特征。虽然部分细胞类型的比例在两者之间存在差异，但总体上表明猪和人类 ROs 在分子水平上具有一定的等效性。
四、研究讨论
在推进 hPSC 来源的视网膜细胞替代疗法的临床应用过程中，临床前动物模型的测试至关重要。然而，异种移植研究存在局限性，如免疫不相容性和关键蛋白的结构差异，可能导致对人类安全性和有效性预测的不准确。此外，动物接受高强度免疫抑制方案会增加全身毒性和感染的风险，限制了长期体内研究的开展。相比之下，同种异体移植可以使用较低水平的免疫抑制，更有利于纵向数据的收集，并且可能更好地代表未来人类临床试验中使用的方案。
猪因其与人类的结构相似性和成本效益，在视网膜细胞移植研究中越来越受到关注。研究人员致力于生成转基因猪 RDD 模型，进一步扩大了猪在治疗开发中的应用。本研究通过优化 MEF 饲养层密度和调整分化方案，成功地从 piPSCs 中生成了 ROs，为提供与 hPSC 来源的视网膜细胞具有相似细胞和分子特性的神经视网膜细胞来源奠定了基础。
通过多种技术对 piPSC - ROs 进行分析发现，其细胞类型在不同阶段的变化与人类 ROs 具有一定的相似性。然而，猪和人类 ROs 也存在一些差异，例如猪 ROs 中 PRs 的总体百分比更高，且杆状与锥状 PR 的比例不同，猪 ROs 中 PRs 的外段样结构较短等。这些差异的潜在机制尚不清楚，但可能与 RPCs 的默认编程以及 piPSCs 和 hPSCs 来源的 PRs 在体外成熟过程中的内在差异有关。未来可能需要进一步优化猪 ROs 的分化方案，以调节杆状与锥状 PR 的比例和促进 PRs 的发育。
本研究首次报道了从 piPSCs 生成 ROs，并通过 scRNA - seq 对不同物种来源的 ROs 进行了比较。研究结果表明，不同物种的 ROs 在分化过程中依赖于内在编程，且优化视网膜分化方案的早期步骤至关重要。piPSC - ROs 为测试 PRs、RGCs 和其他神经视网膜细胞类型在猪视网膜损伤和 RDDs 模型中的功能整合潜力提供了良好的供体来源。未来的同种异体移植研究将有助于完善视网膜细胞替代策略，并研究眼部对同种异体视网膜下移植的免疫反应。
