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总结：本文介绍 Cas9-CLIPT 技术，可简化供体模板制备，提高 CAR T 细胞敲入效率，推动免疫细胞治疗发展。
### 引言
嵌合抗原受体（CAR）T 细胞疗法在对抗血液系统恶性肿瘤方面已取得一定成果，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准多种相关疗法。然而，当前自体基因工程 T 细胞的制造技术存在诸多局限，如制造时间长、成本高且偶尔会出现制造失败的情况。例如，首个获批的 CAR T 产品 tisagenlecleucel，从白细胞单采到重新输注需要 3 - 4 周，每位患者需输注约 0.1 - 10 亿个治疗细胞来完成一个剂量的 CAR T 细胞疗法，且临床制造过程的失败率在 1% - 13%。此外，由于病毒转导的 T 细胞存在引发继发性恶性肿瘤的风险，非病毒递送 CAR 转基因的研究日益受到关注。
CRISPR-Cas9 基因组编辑技术为 T 细胞的基因工程改造提供了新途径。短引导 RNA（gRNA）与 Cas9 核酸酶形成的核糖核蛋白（RNP）能够在基因组的特定位置产生双链断裂（DSBs），这些断裂可通过易错的非同源末端连接（NHEJ）敲除基因，或通过同源定向修复（HDR）整合外源 DNA。将 CAR 转基因整合到内源性 T 细胞受体 α 链（TRAC）启动子上游，可产生具有干细胞记忆样表型的 TRAC-CAR T 细胞，这种细胞在体内具有更强的持久性，有利于治疗血液系统恶性肿瘤和实体瘤。
传统的 TRAC-CAR T 细胞制造依赖于病毒载体或通过聚合酶链反应（PCR）产生的线性双链 DNA（dsDNA）HDR 供体模板。但这些方法存在诸多问题，如限制性酶切和 DNA 纯化过程耗时、昂贵且会降低供体 DNA 模板产量；PCR 扩增的产品质量不稳定且难以放大规模；dsDNA 模板还会导致高细胞毒性和低敲入效率，尤其当模板大于 1.5 kb 时，会限制 CAR T 细胞的产量。线性单链 DNA（ssDNA）作为一种替代方法，虽能提高 T 细胞敲入和活力，但容易发生胞苷脱氨，导致基因组 DNA 出现碱基替换突变。相比之下，质粒 DNA 易于生产、储存和运输，纳米质粒（Nanoplasmid）平台可用于大规模生产符合良好生产规范（GMP）的质粒 DNA，且纳米质粒作为 HDR 供体模板可提高 TRAC-CAR T 细胞产量，并减少转基因沉默。
此前研究尝试将 gRNA 靶序列整合到质粒 dsDNA 中以产生基于 RNP 的线性 DNA 模板，虽在通过同源介导末端连接（HMEJ）实现转基因敲入方面取得一定进展，但存在非靶向插入、成本增加和电穿孔（EP）体积受限等问题。因此，开发一种更高效、简便的非病毒 CAR T 细胞制造方法迫在眉睫。
结果
- 制造 Cas9-CLIPT TRAC-CAR T 细胞：研究人员构建了两种不同的 HDR 模板，即含有 TRAC 单导向 RNA（sgRNA）靶序列的圆形 Cas9-CLIPT 模板和通过 SspI 限制性位点线性化的对照圆形质粒。凝胶迁移实验表明，Cas9-CLIPT 纳米质粒能与 RNP 基于 sgRNA 序列形成复合物，并在与匹配的 RNP 孵育数分钟内线性化。多次冻融后，对照纳米质粒变得不均一，而 Cas9-CLIPT 纳米质粒仍保持均一。
在 T 细胞工程实验中，用 Cas9-CLIPT 模板和靶向 TRAC 位点的 sgRNA - Cas9 RNP 电穿孔 T 细胞，结果显示，使用 Cas9-CLIPT 作为供体模板时，CAR+细胞数量在电穿孔后第 5 天（第 8 天）比对照 TRAC-CAR T 细胞增加了 1.7 倍（Cas9-CLIPT：61% [3%]，对照：36% [1%]；p < 0.001）。添加聚 - l - 谷氨酸（PGA）和 DNA-PK 抑制剂 Nedisertib（M3814）可进一步提高敲入效率。此外，在不同电穿孔仪器上进行实验，结果表明 Cas9-CLIPT 纳米质粒在多种电穿孔条件下均能提高敲入效率。
2. Cas9-CLIPT TRAC-CAR T 细胞的靶向基因组分析：通过对制造第 10 天的细胞产品进行长读长测序，证实了 Cas9-CLIPT 供体模板插入 TRAC 位点。分析结果显示，在 TRAC 靶点处形成了高频率的插入缺失（indel），表明发生了高效的靶向基因组编辑，且 Cas9-CLIPT 和对照 TRAC-CAR T 细胞的 indel 模式无显著差异。通过计算等位基因敲入效率发现，Cas9-CLIPT 的精确插入百分比更高（Cas9-CLIPT：35% [2.2%]，对照：30% [1.7%]，未转染：0.0% [0.0%]；p = 0.038）。由于 PCR 偏向性，测序得到的等位基因敲入效率低于流式细胞术结果。
3. Cas9-CLIPT TRAC-CAR T 细胞的脱靶基因组分析：为检测 Cas9-CLIPT TRAC-CAR T 细胞中是否存在脱靶位点，研究人员进行了全基因组测序（WGS）。结果显示，在 3367 个读取中，有 3270 个（97.3%）与 CAR 转基因发生了靶向整合，脱靶整合在大多数人类染色体上极少出现。部分脱靶命中可能是由于 CAR 转基因的单链可变片段（scFv）与位于 2 号和 22 号染色体上的免疫球蛋白基因座对齐。总体而言，使用 Cas9-CLIPT 纳米质粒时，脱靶整合的风险较低。
4. Cas9-CLIPT TRAC-CAR T 细胞的表型分析：体外培养 CAR T 细胞时，人工激活和高浓度细胞因子可能导致其分化为短寿命的效应 T 细胞，而保留幼稚、干细胞记忆 T 细胞群体可增加 CAR T 细胞的持久性。对 Cas9-CLIPT TRAC-CAR T 细胞进行表型分析发现，其具有平衡的 CD8 和 CD4 T 细胞产物，且含有大量的幼稚 T 细胞（8% [6%] TN，37% [10%] TN - CM），表明该细胞具有干细胞记忆样表型。
5. Cas9-CLIPT TRAC-CAR T 细胞的效力：通过测量与 GD2+神经母细胞瘤细胞系 CHLA-20 共培养后的细胞毒性，评估 Cas9-CLIPT TRAC-CAR T 细胞的效力。结果显示，所有实验组在不同效应细胞与靶细胞（E:T）比例下，均能在 72 小时内成功裂解 CHLA-20 细胞，且在 1.25:1 的 E:T 比例下，Cas9-CLIPT 和对照 TRAC-CAR T 细胞的细胞毒性无显著差异（Cas9-CLIPT：66% [22%]，对照：70% [19%]，仅癌细胞：0% [0%]；p（Cas9-CLIPT 或对照与仅癌细胞相比） = 0.001），表明 Cas9-CLIPT 整合策略可在体外产生有效的 TRAC-CAR T 细胞。
6. 使用 Cas9-CLIPT 进行大转基因敲入：为探索 Cas9-CLIPT 策略能否用于更大的转基因，研究人员构建了含有激活 T 细胞的核因子 - mCherry（NFAT-mCh）的圆形 Cas9-CLIPT 纳米质粒。实验结果表明，使用该大质粒可观察到高敲入效率（NFAT-mCh 敲入：38% [4%]）和极低的 TCR 表达（NFAT-mCh TCR 敲除：99% [0.5%]），表明 Cas9-CLIPT 策略可成功编辑插入大于 5 kb 基因的 T 细胞。刺激 NFAT-mCh CAR T 细胞后，通过流式细胞术检测发现，刺激组的 mCherry 高表达细胞百分比和平均荧光强度（MFI）均显著高于未刺激组，且抗原刺激的 NFAT-mCh CAR T 细胞的 mCherry 表达高于未刺激细胞，表明整合的构建体可产生功能性 CAR T 细胞。
7. NFAT-mCh TRAC-CAR T 细胞的靶向基因组分析：对 NFAT-mCh TRAC-CAR T 细胞进行长读长测序，证实了 NFAT-mCh 转基因通过 HDR 精确插入基因组。分析结果显示，在 TRAC 靶点处形成了高频率的 indel，且 NFAT-mCh、Cas9-CLIPT 和对照 TRAC-CAR T 细胞的 indel 模式无显著差异。计算得到 NFAT-mCh 的精确插入效率为 14% [2.4%]（p < 0.0001）。
8. NFAT-mCh TRAC-CAR T 细胞的效力：通过活细胞成像平台检测发现，Cas9-CLIPT NFAT-mCh CAR T 细胞与 GD2+神经母细胞瘤细胞共培养时，可检测到 NFAT 驱动的 mCherry 荧光，且在不同 E:T 比例下，所有实验组均能成功裂解 CHLA-20 细胞。在 1.25:1 的 E:T 比例下，NFAT-mCh 的细胞毒性为 64% [14%]（与仅癌细胞相比，p = 0.005），表明 Cas9-CLIPT 整合策略可通过功能性大转基因产生有效的 GD2 TRAC-CAR T 细胞。
讨论
研究人员成功开发了一种简化的无病毒 TRAC-CAR T 细胞制造流程，通过将单个 TRAC 靶序列添加到含有 CAR 的纳米质粒中，制备了 Cas9-CLIPT，避免了传统线性化 HDR 供体模板制备过程中的繁琐步骤。纳米质粒可在重组细菌中大规模生产，符合 GMP 条件，且已应用于临床试验，使 Cas9-CLIPT 平台适用于临床 TRAC-CAR T 细胞疗法的生产。使用 Cas9-CLIPT 制造 TRAC-CAR T 细胞可显著提高敲入效率，与使用逆转录病毒生产 CAR T 细胞的效率相当。
在部分实验中，添加 PGA 可辅助 CAR 敲入，其可能通过防止 RNP 聚集发挥作用，但 PGA 对其他非病毒 CAR T 细胞工作流程的影响并不一致，可能存在供体依赖性。此外，Cas9-CLIPT 与带有核定位信号（NLS）的 SpCas9 结合，可能增加其向细胞核的转运，从而提高敲入效率。同时，结合的 Cas9 可能有效切割供体模板和基因组靶标，增加 HDR 的机会。
在 DNA 修复机制方面，虽然存在微同源介导的末端连接（MMEJ）或 HMEJ 等其他末端连接整合过程的可能性，但通过对 Cas9-CLIPT TRAC-CAR T 细胞的测序分析，未观察到 MMEJ 修复的特征，推测 HDR 可能是主要的 DNA 修复机制，这可能与添加 Nedisertib 抑制末端连接修复机制有关。此外，同时抑制 DNA-PK 和聚合酶 theta 介导的末端连接，可进一步提高敲入效率，但需要优化药物组合以确保临床相关的 CAR T 细胞产量。
在 Cellares 的电穿孔系统（CEP）上进行 Cas9-CLIPT 纳米质粒的敲入实验，为实现自动化和规模化的 TRAC-CAR T 细胞治疗生物制造提供了可行性证明。与当前商业 CAR T 细胞制造流程相比，CEP 系统具有诸多优势，如可并行制造多个细胞治疗批次，减少设施规模和劳动力需求，降低过程失败率和批次价格。
Cas9-CLIPT 供体模板简化了非病毒 CAR T 细胞的生产过程，避免了昂贵且难以放大规模的 dsDNA 线性化和纯化步骤。研究人员在制造过程中实现了 Cas9-CLIPT TRAC-CAR T 细胞 8.8 倍的扩增，且将 CAR 敲入效率提高到 60% 以上（插入片段为 2.2 kb）。与重组腺相关病毒（rAAV）供体模板相比，Cas9-CLIPT 可有效插入更大的转基因（5.5 kb 的诱导荧光报告基因），突破了 rAAV 4.5 kb 的载量限制，有望实现更大转基因的敲入，为在 TRAC-CAR T 细胞中纳入更多基因的共表达提供了可能，从而进一步提高基因编辑免疫细胞治疗的安全性和有效性。
材料和方法
- 细胞系：使用的细胞系包括 GD2+人类神经母细胞瘤 CHLA-20 细胞、AkaLUC-GFP CHLA-20 细胞和 3T3 细胞。CHLA-20 细胞在添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素 / 链霉素（P/S）的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养，AkaLUC-GFP CHLA-20 细胞通过病毒转导获得，3T3 细胞在同样的培养基中培养。细胞通过短串联重复分析、细胞形态学、生长曲线和支原体检测进行鉴定，并在 37°C、5% CO2的条件下培养。
- 纳米质粒构建：合成并验证编码 2A.14G2A-CD28-OX40-CD3ζ CAR 的 GD2-CAR 质粒构建体（对照），通过诱变将编码 TRAC sgRNA 加 PAM 的序列克隆到纳米质粒中，得到 Cas9-CLIPT。另外，设计并合成了含有六个 NFAT 反应元件、最小 IL-2 启动子和 H2B-mCh 报告基因的 Cas9-CLIPT NFAT-mCh 构建体。所有转基因均两侧带有 500-bp 的同源臂，并克隆到 pUC57 骨架上，后克隆到纳米质粒骨架中。纳米质粒通过专有大肠杆菌发酵工艺和常规 DNA 纯化流程制造，最终重悬于无 DNase 的水中，浓度为 2 mg/mL。
- 纳米质粒线性化：对照纳米质粒通过 SspI-HF 限制性内切酶进行线性化，反应后进行凝胶电泳评估切割效果，再通过磁珠固相可逆固定化（SPRI）方法纯化和浓缩。PCR 生成的 dsDNA HDR 模板则通过对质粒进行 MidiPrep，然后用 Q5 热启动聚合酶进行 PCR 扩增，再经两轮 SPRI 纯化得到。
- T 细胞分离与培养：从健康供体的外周血中通过阴性选择分离 CD3+原发性人类 T 细胞，将其重悬于 TexMACS 细胞培养基中，添加 IL-7 和 IL-15，并使用 T 细胞 TransAct 刺激 72 小时。激活后的 T 细胞用于后续的电穿孔实验，电穿孔后在含有 IL-7 和 IL-15 的 ImmunoCult-XF 培养基中培养 7 天，期间定期计数和调整细胞密度。
- 电穿孔实验：分别在 Lonza 4D-Nucleofector X Unit、CEP 系统和 Thermo Fisher Neon NxT 电穿孔系统上进行 T 细胞电穿孔实验。在每个系统中，将靶向 TRAC 位点的 sgRNA 与 SpCas9 和 PGA（部分实验）孵育形成 RNP 复合物，再与线性化的 dsDNA HDR 模板混合，然后电穿孔到 T 细胞中。电穿孔后，细胞在特定培养基中培养，并添加相应的细胞因子和小分子抑制剂。
- 检测与分析方法：通过流式细胞术检测 CAR 和 TCR 的表达，使用特定抗体进行染色，在 Attune NxT 或 Aurora 光谱流式细胞仪上进行分析。通过刺激 CAR T 细胞，检测 NFAT 驱动的 mCherry 表达，评估细胞的功能。使用 IncuCyte S3 活细胞分析系统进行体外细胞毒性测定，通过计算绿色物体数量评估癌细胞数量。通过光谱流式细胞术数据分析软件 SpectroFlo 和 FlowJo 对数据进行分析和处理。此外，还进行了线性化凝胶实验、DNA 提取和 PCR 扩增、牛津纳米孔技术测序和全基因组测序等实验，以分析纳米质粒的线性化情况、基因组编辑效率和脱靶位点等。
数据可用性
数据可向相应作者 Krishanu Saha（ksaha@wisc.edu）索取。
致谢
研究团队感谢 Saha 实验室成员的实验建议，以及 Capitini 和 Sodji 实验室在实验设施上的支持。同时感谢威斯康星大学 Carbone 癌症中心流式细胞术实验室提供的设施和服务，以及众多研究人员在实验和讨论中的帮助。研究得到了多项基金的资助，包括 NIH R01 CA278051、NSF-EEC 1648035 等。
作者贡献
多位作者在研究中发挥了不同作用，包括开发线性化 HDR 模板的制备方法、进行纳米质粒实验操作、设计构建体和克隆工作流程、提供技术指导、优化电穿孔协议、进行细胞实验、数据分析和撰写论文等。
利益声明
部分作者是相关专利的发明人，部分作者受雇于 Aldevron 公司，该公司拥有纳米质粒产品和技术的专利。部分作者还在其他公司担任顾问并持有股权。
