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研究人员评估 qPCR 诊断方法检测脆弱双核阿米巴（Dientamoeba fragilis）新动物宿主的效果，发现存在交叉反应和假阳性问题。
在神秘的微观世界里，寄生虫与人类和动物的健康紧密相连，脆弱双核阿米巴（Dientamoeba fragilis）便是其中一位备受关注的 “神秘客”。自 1918 年被发现以来，它就像一团迷雾，围绕其传播途径、临床意义等问题，科学界一直争论不休。从传播途径来看，到底是借助蠕虫卵（如蛲虫 Enterobius vermicularis）传播，还是通过粪便 - 口腔途径传播包囊阶段，至今尚无定论。在临床意义方面，它究竟是引发肠胃炎的 “罪魁祸首”，还是与人体和平共处的 “过客”，也没有统一的答案。
近年来，随着 “同一健康”（One Health）理念的兴起，人们愈发认识到人类、动物和环境健康之间的紧密联系，对脆弱双核阿米巴潜在动物宿主的研究也逐渐增多。通过各种分子技术，研究人员发现了许多潜在宿主，如大鼠、牛、猪等，但这些结果大多未得到进一步证实。而且，不同研究报道的人类感染脆弱双核阿米巴的患病率差异极大，从 2% 到 71% 不等，这背后的原因也扑朔迷离。更让人困惑的是，现有研究难以确定动物宿主与人类感染之间的关系，以及诊断方法在检测过程中是否可靠。在这样的背景下，开展一项深入研究来解开这些谜团就显得尤为重要。
来自悉尼科技大学（University of Technology Sydney）和悉尼圣文森特医院（St Vincent’s Hospital）的研究人员，针对这些问题展开了一项关键研究。他们的研究成果发表在《Parasites & Vectors》杂志上，为我们理解脆弱双核阿米巴的传播和诊断带来了新的曙光。
研究人员为了深入探究脆弱双核阿米巴的奥秘，采用了多种先进的技术方法。首先，他们收集了 49 头牛、84 只狗、39 只猫以及 254 名人类的粪便样本。在样本处理上，动物样本一部分用于显微镜观察，另一部分用于分子检测；人类样本则经过去标识化处理后用于后续研究。其次，研究人员使用了两种实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测方法，即 EasyScreen（Genetic Signatures）和一种欧洲常用的实验室自制检测方法，对样本进行检测。为了验证检测结果的准确性，他们还运用了熔解曲线分析（melt curve analysis）、针对小亚基核糖体核糖核酸（SSU rDNA）的常规聚合酶链式反应（cPCR）测序和下一代测序（NGS）扩增子测序等技术。
研究结果主要有以下几个方面：
- 动物样本检测结果：在狗和猫的样本中，研究人员未检测到脆弱双核阿米巴。而在牛的样本检测中，出现了意想不到的情况。最初的 qPCR 检测结果显示，大量牛样本似乎感染了脆弱双核阿米巴，但熔解曲线分析却发现，这些样本的熔解曲线与人类感染样本差异显著，温度相差约 9°C，这表明检测到的可能并非脆弱双核阿米巴。后续通过测序分析确定，导致这种交叉反应的是 Simplicimonas sp.，并非脆弱双核阿米巴。
- 人类样本检测结果：两种 qPCR 检测方法在检测人类样本时，出现了较大差异。EasyScreen 检测出 24 个阳性样本，而实验室自制检测方法则多检测出 34 个阳性样本。经过进一步的 NGS 扩增子测序分析，发现其中 5 个样本确实存在脆弱双核阿米巴，另外 29 个样本则为假阳性。研究人员还发现，这些假阳性样本的循环阈值（Ct）较高，通常≥40，这表明高 Ct 值可能与非特异性扩增有关。
在研究结论与讨论部分，此次研究具有重要意义。一方面，研究表明仅依靠 qPCR 技术无法准确确定动物是否为脆弱双核阿米巴的宿主，还需要结合熔解曲线分析、测序和 / 或显微镜检查等方法，才能得出确切结论。这为今后研究新的动物宿主提供了关键的方法学指导。另一方面，研究发现人类样本检测中存在较高的假阳性率，建议在使用实验室自制检测方法时，将 PCR 循环次数控制在 35 - 40 次之间，以降低假阳性风险，避免患者接受不必要的治疗。此外，此次研究还引发了对脆弱双核阿米巴流行病学和传播机制的深入思考，未来需要开发更具特异性的 qPCR 检测方法，以提高检测的准确性，为公共卫生防控提供有力支持。
总之，这项研究为我们进一步了解脆弱双核阿米巴的宿主范围、传播机制以及诊断方法的准确性提供了重要依据，在寄生虫学研究领域迈出了坚实的一步，也为后续相关研究指明了方向。
