大肠杆菌 “变身”：将甲酸高效转化为甲基基团，开启绿色生物合成新篇

研究人员为探索新原料用于生物技术，研究大肠杆菌利用甲酸合成甲基，发现可提升全细胞甲基化，意义重大。

　　### 研究背景：绿色化学需求下的探索之旅
在当今的工业领域，大多数合成过程严重依赖化石资源，从生产天然产品、燃料，到制造聚合物和精细化学品（包括药品）等。然而，随着化石资源的日益枯竭和气候变化问题的加剧，实现化学工业的绿色转型、减少对化石资源的依赖迫在眉睫。

在众多解决方案中，利用二氧化碳（CO₂）衍生的原料成为了一个极具潜力的方向。甲酸（formate）作为一种由 CO₂或有机废物转化而来的一碳（C₁）化合物，凭借其稳定性、可生物降解性、易于处理和低毒性等优点，成为了生物转化领域的 “潜力新星”。在自然的微观世界里，有一种神奇的反应 ——S - 腺苷甲硫氨酸（SAM）依赖的甲基化反应，由甲基转移酶（MTs）催化，它能将 C₁化合物转移到各种分子上。这一过程不仅参与了 DNA 或组蛋白的甲基化，调控基因表达，还在药物研发中发挥着关键作用。一些天然产物和药物经过甲基化后，生物活性大幅提升，然而传统化学甲基化方法存在诸多弊端，如难以定向引入甲基、需在耗能条件下进行，且使用的甲基化试剂往往有毒且对环境有害。

与此同时，在生物技术生产中，细胞内的甲基化活性常常成为合成甲基化产物的 “瓶颈”。为了突破这一限制，科学家们尝试了多种方法，如优化细胞内 SAM 的可用性、加速其再生等。而本研究的科学家们大胆设想，能否利用甲酸作为理想的 C₁ - 构建模块，为生物技术宿主的 C₁- 四氢叶酸（C₁-H₄F）代谢提供燃料，推动全细胞甲基化向前发展呢？带着这样的疑问，来自多个研究机构的研究人员开启了这次探索之旅，其研究成果发表在《Microbial Cell Factories》上。

研究方法：微观世界的 “改造术”

为了实现研究目标，研究人员采用了多种关键技术。在菌株构建方面，运用 λ - 红重组工程和 P1 噬菌体转导技术，对大肠杆菌（E. coli）进行基因编辑，构建出一系列工程菌株，如 C₁-opt 和 C₁S 等，这些菌株在后续研究中发挥了重要作用。在质粒构建上，使用无缝 InFusion 克隆技术，将相关基因克隆到合适的载体中，实现基因的表达和调控。在检测分析时，借助高效液相色谱 - 紫外检测（HPLC - UV）和液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）技术，对甲基化产物进行定量和定性分析，从而获取关键数据。

研究结果：甲酸转化的奇妙发现

1. N - 甲基化：甲酸的初步 “变身” 成果
   研究人员首先将携带甲酸同化基因（fcm）的质粒和含有 rganmt 基因的载体转化到大肠杆菌 BL21 中，构建出 BL21 - fcm - rganmt 菌株。实验发现，引入 fcm 基因虽能提高产物生成，但添加 5mM¹³C - 甲酸后，转化率并未如预期提升。不过，LC - MS/MS 分析显示，67% 的产物 N - 甲基 - 2,5 - 氨基硝基苯酚（M - 2,5 - ANP）被¹³C 标记，这表明甲酸成功转化为甲基基团并参与了甲基化反应。为了找到转化率受限的原因，研究人员尝试共表达多个相关基因。结果发现，共表达 ecmat 和 mmsahh 基因时，BL21 - fcm - rganmt - ecmat 菌株甚至无法产生甲基化产物，而共表达 ecmetF 基因时，转化率仅有小幅度增加，这说明将甲酸转化为甲基基团的过程存在一定的 “阻碍”。
2. Chemoselective C - 和 O - 甲基化：甲酸的多样 “变身”
   研究人员进一步探索其他 MTs 是否也能利用甲酸衍生的 SAM 进行甲基化反应。选择了咖啡酸 O - 甲基转移酶（PpCaOMT）和来自链霉菌的 C - 甲基转移酶（CouO）进行实验。结果令人惊喜，实验后发现，2,4 - 甲氧基硝基苯胺（2,4 - MNA）和 1 - 甲基 - 2,7 - 二羟基萘（M - DHN）的¹³C 标记比例分别达到 51% 和 81%，且共表达 EcMAT 和 CouO 能显著提高产物生成量，这表明甲酸衍生的甲基基团在不同 MTs 催化下具有广泛的适用性。
3. 筛选工程菌株：寻找高效转化的 “潜力股”
   由于 BL21 - fcm - rganmt 菌株在转化甲酸时存在局限性，研究人员将目光转向基于大肠杆菌 K - 12 MG1655 构建的工程菌株。通过删除相关基因构建出 C₁-auxotrophic 菌株 C₁-opt 和丝氨酸依赖的 C₁-auxotrophic 菌株 C₁S，并在这些菌株中引入 fcm 基因和阿拉伯糖诱导的 T7 RNA 聚合酶系统。实验结果显示，C₁S - rganmt 菌株在添加 5mM¹³C - 甲酸后，产物生成量明显增加，虽然其¹³C 标记的 M - 2,5 - ANP 比例仅为 15%，但综合考虑转化率的提升，研究人员决定聚焦该菌株进一步研究。
4. 优化甲基化：提升转化效率的探索
   研究人员对 C₁S - rganmt 菌株进行深入研究，探索甲酸浓度对产物生成的影响。结果发现，当甲酸浓度在 2.5 - 10mM 时，产物生成量显著增加，在 10mM¹³C - 甲酸时达到峰值，此时产物生成量比 BL21 - fcm - rganmt - metF 添加 5mM¹³C - 甲酸时高出 2.1 倍。但过高的甲酸浓度（如 75mM）会抑制产物生成。此外，研究人员还发现，添加甘氨酸对转化率影响不大，不过会使¹³C 标记产物的比例略有降低。最后，研究人员共表达 SAM 再生循环相关基因和 ecmetF 基因，发现共表达 ecmtan 和 ecluxS 基因能使产物生成量略有增加，这表明去除 S - 腺苷同型半胱氨酸（SAH）并再生为同型半胱氨酸可能是影响全细胞甲基化的一个小因素。

研究结论与讨论：开启生物合成新篇章

本研究成功证明了大肠杆菌可以通过引入甲基杆菌的甲酸同化机制，将甲酸转化为甲基基团。在不同菌株中，甲酸衍生的甲基基团在甲基化反应中表现出不同的效率和适用性。BL21 - fcm - rganmt - ecmetF 菌株能实现 67% 的¹³C 标记产物甲基化，而 C₁S - rganmt 菌株在添加甲酸后，转化率提高了 57%，¹³C 标记产物比例达到 34%。

然而，目前的研究仍存在一些问题。例如，C₁S - rganmt 菌株中，随着甲酸供应增加，甲基基团的掺入呈现非线性变化，研究人员推测可能是碳源衍生的未标记 C₁化合物干扰所致。此外，该菌株的最高总转化率仅为 46%，还有很大的提升空间。未来研究可以通过删除相关基因（如 ecpfl 或 ecltae）来抑制未标记 C₁化合物的形成，提高甲酸的转化效率。同时，通过进行通量分析，找出代谢过程中的关键瓶颈，引入辅助酶（如甲酸脱氢酶）等方法，有望进一步提升菌株的性能。

总体而言，这项研究为利用可再生的 C₁化合物甲酸支持 SAM 依赖的甲基化反应提供了一种简单有效的策略，为未来生物合成领域的发展开辟了新的道路，在绿色化学和生物技术领域具有重要的应用前景。