NagPIBAF 上调和 ompO 下调影响嗜麦芽窄食单胞菌氧化应激耐受性的研究

为探究嗜麦芽窄食单胞菌 KJ 的 OmpA C 端缺失突变体耐氧化应激能力下降的机制，研究人员发现 NagPIBAF 操纵子和 ompO 协同作用影响其耐受性，拓展了相关调控机制认知。

　　在细菌的微观世界里，它们的生存面临着诸多挑战，其中氧化应激就是一个大难题。细菌通过有氧呼吸获取能量，就像人类呼吸一样，但这个过程会产生一些 “副产品”，比如活性氧（ROS），包括超氧阴离子（O2?）、过氧化氢（H2O2）和羟基自由基（HO?）。这些 ROS 可不安分，它们会对细菌的生物分子发起 “攻击”，造成非特异性氧化，严重威胁细菌的生存。

为了应对 ROS 的威胁，细菌进化出了多种防御手段，比如一些酶系统可以清除 ROS，还有修复系统能把被氧化的生物分子 “修复如初”。同时，细菌还会巧妙地利用环境中的营养物质，N - 乙酰葡糖胺（GlcNAc）就是一种对细菌很重要的物质，它既是细菌细胞壁肽聚糖（PG）的结构成分，也是碳源和氮源。

在革兰氏阴性菌中，外膜蛋白 OmpA 是个 “明星分子”。它由两个结构域组成，N 端的 β- 桶状结构像一个通道，负责物质进出，C 端的球状结构域则与肽聚糖层紧密相连，对维持细菌外膜和肽聚糖的完整性至关重要。嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）KJ 是一种临床分离菌，之前的研究发现，其 OmpA 的 C 端缺失突变体KJ△OmpA299?356在面对氧化应激时表现不佳，比如对超氧阴离子生成剂甲萘醌（MD）的耐受性下降。但当时并不清楚除了已知的σE、σN和 ompO 参与其中，还有没有其他未知因素在捣鬼。

为了揭开这个谜团，来自多个机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《BMC Microbiology》杂志上，这一成果对于深入了解嗜麦芽窄食单胞菌的氧化应激耐受机制具有重要意义。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：一是转录组分析，对比野生型 KJ 和KJ△OmpA299?356的基因表达差异，寻找潜在的关键基因；二是反向转录聚合酶链反应（RT-PCR），验证基因的表达情况；三是构建基因缺失突变体，通过敲除特定基因来研究其对细菌表型的影响；四是测定细胞内 ROS 水平，直观地了解细菌在不同条件下的氧化应激状态。

下面来看看具体的研究结果：

1. NagPIBAF 操纵子上调影响氧化应激耐受性：通过转录组分析，研究人员发现KJ△OmpA299?356中有一个五基因簇 Smlt4023 - Smlt4019，也就是后来命名的 nagP - nagI - nagB - nagA - nagF（NagPIBAF）操纵子上调了。qRT-PCR 进一步证实了转录组结果的可靠性。构建缺失突变体实验表明，敲除 NagPIBAF 操纵子后，KJ△NagPIBAF△OmpA299?356的 MD 耐受性恢复到了野生型水平，这说明 NagPIBAF 操纵子的上调确实与KJ△OmpA299?356的 MD 耐受性下降有关。而且，RT-PCR 实验还证实了 NagPIBAF 是一个操纵子，并且它参与了 GlcNAc 的利用，敲除该操纵子的菌株在以 GlcNAc 为唯一碳源的培养基中生长受限。
2. NagPIBAF 操纵子的调控机制：NagI 属于 LacI 家族转录调节因子，通常起抑制作用。研究发现，敲除 nagI 基因后，KJΔNagI(pNagPxiE)中编码的儿茶酚 - 2,3 - 双加氧酶（C23O）活性大幅增加，这表明 NagI 对 NagPIBAF 操纵子的表达有负调控作用。同时，在 GlcNAc 的刺激下，KJ(pNagPxyz)中 C23O 活性显著上升，说明 NagPIBAF 操纵子能被 GlcNAc 诱导表达。此外，研究还排除了 nagI 基因上游存在单独启动子的可能性。
3. NagP、nagB 和 nagA 对 MD 耐受性的影响：为了明确 NagPIBAF 操纵子中各基因的具体作用，研究人员分别构建了ΔnagP、ΔnagB、ΔnagA和ΔnagF突变体并进行 MD 耐受性检测。结果发现，KJ△NagP△OmpA299?356、KJ△NagA△OmpA299?356和KJ△NagB△OmpA299?356部分恢复了 MD 耐受性，而KJΔNagFΔOmpA299?356则没有，这表明 NagP、nagB 和 nagA 的上调是导致KJ△OmpA299?356的 MD 耐受性下降的重要因素。
4. NagPIBAF 操纵子与 ompO 的协同作用：之前研究已知 ompO 下调参与了KJ△OmpA299?356的 MD 耐受性下降过程。在本研究中，构建的 nagI 和 ompO 双敲除突变体 KJ?OmpO?NagI，其 MD 耐受性明显下降，而单独敲除 nagI 或 ompO 对野生型 KJ 的 MD 耐受性影响不大。同时，检测细胞内 ROS 水平发现，在 MD 处理下，KJ△OmpA299?356的 ROS 水平升高，敲除 NagPIBAF 操纵子或过表达 ompO 可使其恢复到野生型水平；在野生型背景下，KJ?OmpO?NagI 的 ROS 水平升高，而单独敲除 nagI 或 ompO 则无明显变化。这些结果表明，NagPIBAF 操纵子上调和 ompO 下调协同作用，导致了 MD 耐受性下降。
5. σN对 NagPIBAF 操纵子的调控：研究人员推测 NagPIBAF 操纵子可能是σN调控子的成员，因为之前发现 rpoN 下调与KJ△OmpA299?356的 MD 耐受性下降有关，且 ompO 不属于σN调控子。实验结果证实，敲除 rpoN 基因后，NagPIBAF 操纵子表达上调，说明σN对 NagPIBAF 操纵子表达起负调控作用。此外，研究还发现 NagPIBAF 操纵子上调与KJ△OmpA299?356的游泳运动能力下降无关。
6. NagI 与 ompO 的关系：研究人员检测了 NagI 对 ompO 表达的影响，发现 KJ 和 KJ?NagI 细胞中 ompO 的表达水平相当，初步排除了 NagI 对 ompO 表达的调控作用。

综合上述研究，研究人员得出结论：KJΔOmpA299?356由于 OmpA 与肽聚糖失去接触，引发包膜应激，激活σE，进而下调 ompO 和 rpoN 的表达。rpoN 下调又导致 NagPIBAF 操纵子上调，ompO 下调和 NagPIBAF 操纵子上调协同作用，增加了细胞内 ROS 水平，最终导致KJ△OmpA299?356的 MD 耐受性下降，且 NagI 和 ompO 之间不存在相互调控。

这项研究意义重大，它拓展了人们对KJ△OmpA299?356介导的 MD 耐受性下降调控机制的理解，为深入研究嗜麦芽窄食单胞菌的氧化应激耐受机制提供了新的视角。同时，也为后续开发针对该菌感染的治疗策略提供了潜在的靶点和理论依据，让我们在对抗细菌感染的道路上又迈进了一步。