重组仙台病毒载体 rSeV-GFP-P25：对抗小反刍兽慢病毒感染的新希望

为解决小反刍兽慢病毒（SRLV）感染无有效疫苗和疗法的问题，研究人员构建 rSeV-GFP-P25 并研究，发现其可诱导免疫反应、限制 SRLV 感染，是潜在疫苗候选。

　　小反刍兽慢病毒（Small ruminant lentiviruses，SRLV）就像隐藏在羊和山羊群体中的 “健康杀手”，悄无声息地引发多系统慢性炎症疾病，在全球范围内给畜牧业带来巨大的经济损失。它包含梅迪 - 维斯纳病毒（Maedi-Visna virus，MVV）和山羊关节炎脑炎病毒（caprine arthritis encephalitis virus，CAEV）等，这些病毒 “狡猾” 得很，具有高度的遗传异质性，这使得研发有效的诊断方法和疫苗困难重重。目前，针对 SRLV 感染，尚无可用的疫苗或疗法，现有的疫苗候选方案都存在各种问题，比如活减毒疫苗可能恢复致病性，灭活疫苗有时会加重疾病，亚单位疫苗中的某些蛋白甚至会促进病毒复制 。在这样的困境下，科研人员迫切需要找到新的突破口。

西班牙多个研究机构（包括萨拉戈萨大学、农业生物技术研究所等）的研究人员，如 álex Gómez、Idoia Glaria 等，为了应对 SRLV 感染的难题，开展了一项极具意义的研究。他们构建了一种重组仙台病毒（Sendai virus，SeV）载体 rSeV-GFP-P25，该载体编码 SRLV 的 gag-P25 基因。研究人员对其在体外和体内的转基因表达、诱导的先天免疫反应以及对 SRLV 感染的抗病毒活性进行了深入研究。这一研究成果发表在《Veterinary Research》杂志上，为抗击 SRLV 感染带来了新的希望。

在这项研究中，研究人员用到了几个主要关键的技术方法。首先是细胞培养技术，从无 SRLV 感染的羔羊皮肤活检获取羊皮肤成纤维细胞（ovine skin fibroblasts，OSF）用于后续实验。其次是病毒载体构建和拯救技术，通过 In-FUSION 克隆将 SRLV gag-P25 基因插入 SeV-GFP 质粒，再利用 SeV 反向遗传系统拯救出重组病毒。另外，定量聚合酶链反应（qPCR）技术被用于检测 mRNA 表达、病毒 DNA 载量等；免疫组化技术则用于研究转基因表达和组织分布情况 。

下面来看看具体的研究结果：

1. SeV 载体的生成和滴定：通过荧光显微镜观察到转染 HEK293T 细胞后，SeV-GFP 和 rSeV-GFP-P25 均出现 GFP 阳性细胞，且两种病毒在 144 h 后 GFP 阳性细胞比例都能达到 90 - 100%，最终滴定得到病毒滴度为 10⁶-10⁷ TCID₅₀/mL。
2. 刺激 OSF 的先天免疫反应：不同 Toll 样受体（TLRs）、视黄酸诱导基因 I（RIG-I）、接头蛋白 MyD88 和干扰素 β（IFN-β）的 mRNA 表达，会因所用 SeV 载体和转导时间的不同而变化。rSeV-GFP-P25 能诱导 OSF 中 TLR2、TLR3、TLR6、TLR7、MyD88、RIG-I 和 IFN-β 的过表达，而 SeV-GFP 不能诱导 TLR6 和 IFN-β 的上调。RIG-I 是过表达最明显的基因，在 SeV-GFP 转导的 OSF 中 12 hpt 达到峰值，在 rSeV-GFP-P25 转导的 OSF 中 72 hpt 达到峰值。
3. OSF 中干扰素刺激基因的表达：两种 SeV 载体转导的 OSF 通常会过表达羊的干扰素刺激基因（A3Z1、OBST2 和 SAMHD1）。与 SeV-GFP 相比，rSeV-GFP-P25 在 48 hpt 和 72 hpt 能更显著地上调 OBST2，在 48 hpt 能更显著地上调 SAMHD1。
4. OSF 对 SRLV 的限制作用：研究发现，用 SeV-GFP 或 rSeV-GFP-P25 转导的 OSF 在不同时间点都倾向于减少 SRLV DNA 的拷贝数，不过差异大多不显著。但在 96 hpt 转导后感染 EV1，72 hpi 时，转导 SeV-GFP 和 rSeV-GFP-P25 的 OSF 的 SRLV 病毒载量显著低于阳性对照。而且，转导三次的 OSF 的 SRLV DNA 拷贝数明显少于未转导或转导次数少的对照组。
5. OSF 的抗病毒活性：转导 SeV-GFP 或 rSeV-GFP-P25 后收集的上清液，能降低新鲜 OSF 感染 SRLV 后的病毒 DNA 载量，在 48 hpt 时差异最为显著。
6. OSF 中的转基因表达：通过 GFP 阳性结果证实了 SeV-GFP 和 rSeV-GFP-P25 对 OSF 的转导，rSeV-GFP-P25 转导的 OSF 中，转基因表达高效且呈进行性，在 72 hpt 达到峰值。免疫细胞化学检测也在 72 hpt 的 OSF 中检测到了抗 P25 免疫标记。
7. 组织病理学评估：对羔羊进行 SeV-GFP 和 rSeV-GFP-P25 鼻内接种后，发现接种点有明显的局部反应，包括鼻黏膜和鼻相关淋巴组织（NALT）高度反应性，鼻黏膜纤毛上皮细胞和杯状细胞增生，NALT 淋巴组织增生等，但下呼吸道无明显病理变化。
8. 体内转基因表达：接种 rSeV-GFP-P25 的羔羊在采样组织中呈现轻度转基因表达，鼻黏膜中 P25 表达最高，气管和支气管肺泡灌洗液（BAL）中无转基因表达。免疫组化显示，鼻黏膜纤毛上皮细胞的纤毛中有强烈的 P25 免疫反应性，黏膜下层的炎症细胞中也有少量标记。

研究结论和讨论部分指出，rSeV-GFP-P25 在体外和体内都能诱导高效的转基因表达，引发强大的抗病毒先天免疫反应，并部分限制 SRLV 在羊皮肤成纤维细胞中的感染。这一研究强调了先天免疫反应在控制 SRLV 感染中的重要作用，也表明 rSeV-GFP-P25 是一种潜在的抗 SRLV 疫苗候选。不过，目前还需要进一步研究 rSeV-GFP-P25 在羊受到 SRLV 实验攻击后的保护水平，以及确定参与 SeV 载体诱导的先天免疫反应的具体干扰素或细胞因子类型。 总体而言，这项研究为开发抗 SRLV 感染的新疫苗奠定了重要基础，有望在未来为畜牧业的健康发展提供有力保障。