基因追踪技术揭示小鼠心脏再生奥秘，为心脏疾病治疗带来新曙光

为解决心肌细胞复制监测难题，研究人员开展小鼠心脏再生研究，利用 CycleTrack 技术获重要成果，助力心脏疾病治疗。

　　心脏，这个人体内不知疲倦的 “动力泵”，一旦出现损伤，其再生能力却令人大失所望。与拥有强大心脏再生能力的斑马鱼、蝾螈等动物不同，哺乳动物的心脏在遭受损伤，比如心肌梗死（MI）后，存活的心肌细胞（CMs）增殖活性极低，这使得心脏的自我修复能力非常有限。据估算，人类 CMs 的基础更新率在 25 岁时约为每年 1%，到 75 岁时更是降至 0.45% ，即便受伤后也仅有轻微提升。在过去的研究中，虽然人们对限制成年与新生儿 CM 增殖的分子机制有了更深入的了解，也提出了一些旨在激活成年心脏遗传再生程序的治疗方法，但一个关键问题始终阻碍着研究的进展 —— 缺乏可靠的体内监测 CM 复制的方法。传统用于标记增殖细胞的胸腺嘧啶类似物，在心脏再生研究中暴露出诸多问题，如 DNA 掺入引发损伤反应，导致标记细胞被清除，无法准确反映 CM 的增殖情况。

在此背景下，来自英国伦敦国王学院、意大利国际遗传工程与生物技术中心等机构的研究人员 Ilaria Secco、Ana Backovic、Mateusz Tomczyk 等开展了一项重要研究，相关成果发表在《Nature Cardiovascular Research》上。该研究开发了一种名为 CycleTrack 的遗传策略，为心脏再生研究带来了新的突破。

研究人员在开展此项研究时，主要运用了以下几种关键技术方法：一是构建多种质粒和重组腺相关病毒（AAV）载体，用于驱动基因表达和追踪细胞；二是培养多种细胞系，包括 C2C12 细胞系、U - 2 OS 细胞系等，并进行细胞转染和同步化处理；三是对小鼠进行多种手术操作，如心脏顶端切除、心肌梗死模型构建、横向主动脉缩窄（TAC）等，以模拟不同的生理和病理状态；四是采用免疫荧光染色、流式细胞术等方法对细胞和组织样本进行检测和分析。

研究结果主要包含以下几个方面：

1. 胸腺嘧啶类似物不适用于长期研究：研究人员发现，常用的胸腺嘧啶类似物溴脱氧尿苷（BrdU）和 5 - 乙炔基 - 2′ - 脱氧尿苷（EdU）在标记 CM 复制时存在严重缺陷。在新生小鼠实验中，无论使用何种剂量，BrdU 和 EdU 标记的细胞随时间推移逐渐减少，多次注射也无法增加标记细胞数量，且 EdU 还表现出长期毒性。这表明化学修饰的核苷酸掺入不能可靠地用于可视化循环 CMs 的长期积累。
2. CycleTrack 系统的原理与验证：研究人员基于细胞周期蛋白 B2（CyB；也称为 CCNB2）启动子片段的转录激活开发了 CycleTrack 系统。该启动子片段能在细胞进入 G₂/M 期时精确激活 Cre 重组酶，使复制的 CMs 细胞质永久荧光标记。实验表明，该系统能特异性标记分裂细胞，在不同细胞系和原代 CMs 中都得到了验证。
3. CycleTrack 检测有丝分裂 CMs：在新生小鼠中，使用 AAV9 - CyB - Cre 检测发现，约 64.2% 的 CMs 在 15 天内至少经历一轮分裂，与此前研究结果相符；而在成年小鼠中，该系统检测到的有丝分裂 CMs 极少。同时，研究人员通过实验证实了 CycleTrack 系统的准确性，例如共注射 p21 表达载体可显著减少 CycleTrack 阳性细胞。
4. CycleTrack 可视化心脏再生：对新生小鼠进行心脏顶端切除术后，注射 AAV9 - CyB - Cre 发现，再生过程中 CM 增殖在整个左心室扩散，而非局限于顶端区域。此外，在怀孕的 Z/EG 雌性小鼠中，CycleTrack 检测到怀孕会刺激 CM 增殖，且增殖细胞主要集中在左心室内膜和隔膜附近区域。
5. CycleTrack 检测 CM 增殖及对肥大刺激的反应：研究发现，CycleTrack 对心脏肥大刺激不敏感，在 TAC 诱导的心脏肥大小鼠模型中，CycleTrack 阳性 CMs 数量与对照组无显著差异。同时，在心肌梗死和 miRNA 给药实验中，CycleTrack 可视化并量化了 miR - 199a - 3p 和 miR - 590 - 3p 诱导的 CM 增殖，治疗后梗死区域出现明显的肌肉化。
6. CM 复制模式：通过分析 CycleTrack 阳性细胞的形态，研究人员发现，在大多数情况下，CMs 沿短轴纵向分裂，这为心脏在生理和治疗诱导的复制过程中不引发心律失常提供了一种机制解释。

在结论与讨论部分，研究人员指出，CycleTrack 作为一种遗传标记 CM 有丝分裂的方法，克服了现有其他方法的诸多局限性。与传统的免疫检测细胞周期特异性抗原以及其他遗传系统相比，CycleTrack 能更精确地追踪 CM 有丝分裂，且稳定、无毒，可实现对细胞复制历史的追踪。同时，该技术通过标记 CM 细胞质，不仅能在组织切片中可视化 CM 复制，还能提供 CM 复制发生的心肌区域信息，揭示了心脏损伤后 CM 增殖的全局刺激机制以及 CM 的复制模式。此外，CycleTrack 系统的心肌特异性基于使用亲心肌的 AAV9 载体，这使得该系统具有良好的通用性，可应用于不同小鼠品系甚至更大的动物。

总之，这项研究通过开发 CycleTrack 技术，为心脏再生研究提供了有力的工具，有助于深入理解心脏再生的机制，为未来心脏疾病的治疗提供了新的思路和方向。