编辑推荐：
研究人员针对 GAD65 在自身免疫疾病中的作用展开研究，发现其自身抗原性与构象灵活性相关，为相关疾病研究提供依据。
在人体这个复杂的 “小宇宙” 里，有一种名为谷氨酸脱羧酶（Glutamic acid decarboxylase，GAD）的物质，它就像一位勤劳的 “工匠”，利用磷酸吡哆醛（pyridoxal-5’-phosphate，PLP）生产神经递质 γ- 氨基丁酸（GABA）。GAD 存在两种亚型，分别是 GAD65 和 GAD67，其中 GAD65 可不简单，它是 1 型糖尿病（T1D）等自身免疫疾病中的主要自身抗原。然而，以往对 GAD65 和 GAD67 的研究中，尽管知道它们在序列和结构上有不少相似之处，但为何 GAD65 更容易成为自身免疫攻击的目标，一直是个未解之谜。而且，之前通过静态晶体结构研究，也无法完全解释 GAD65 的自身失活倾向以及它作为自身抗原的具体机制。为了揭开这些神秘的面纱，来自丹麦哥本哈根大学、澳大利亚莫纳什大学等多个研究机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们理解自身免疫疾病的发病机制带来了新的曙光。
研究人员为了探究 GAD65 的结构与动态特征，以及它与自身免疫性多内分泌综合征 2 型（APS-2）相关自身抗体 b96.11 的相互作用，采用了多种先进的技术方法。其中，氢氘交换质谱（HDX-MS）技术用于分析 GAD65 在溶液中的构象动态变化；冷冻电镜（cryo-EM）和 X 射线晶体学技术则帮助研究人员获得 GAD65 与抗体复合物的精细结构。
下面来看看具体的研究结果：
- GAD65 的溶液相动力学
- holoGAD65 的构象动力学：通过 HDX-MS 实验，研究人员发现 holoGAD65 在多个区域表现出非常缓慢的氢氘交换（HDX），这表明这些区域存在稳定的氢键结构。不过，也有一些区域，如覆盖催化环（CL）和部分功能及活性位点的区域，表现出较快的 HDX，说明这些区域在溶液中具有一定的灵活性。这表明，holoGAD65 整体上处于一个相对稳定的构象，但部分关键区域的灵活性对于酶的活性至关重要。
- GAD65 的失活：apoGAD65 的构象动力学：在缺乏 apoGAD65 晶体结构的情况下，研究人员通过比较 apoGAD65 和 holoGAD65 的 HDX，对 PLP 辅因子依赖的 GAD65 自身失活动态进行了实验表征。结果发现，apoGAD65 的大部分肽段表现出比 holoGAD65 更高的 HDX，这意味着 apoGAD65 的构象动力学更强，结构更不稳定。特别是覆盖活性位点和功能位点的区域，在 apoGAD65 中 HDX 更快，说明这些区域在酶失活过程中发生了显著的构象变化。
- GAD65 与 b96.11 抗体结合后的构象动力学：研究人员用 HDX-MS 研究了 apo - 和 holoGAD65 在 b96.11 抗体存在下的溶液相动力学。结果显示，b96.11 与 apoGAD65 结合后，apoGAD65 的多个区域 HDX 显著降低，表明抗体结合导致 apoGAD65 的构象更加稳定。而 b96.11 与 holoGAD65 结合时，引起的构象变化相对较小。此外，研究还发现 b96.11 与 holoGAD65 的结合亲和力高于与 apoGAD65 的结合亲和力。
- GAD65 - b96.11 复合物的结构表征
研究人员利用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）和 X 射线晶体学对 apoGAD65 与 b96.11 的相互作用进行了结构表征。结果表明，b96.11 主要与 apoGAD65 二聚体的 CTD 和 PLP 结构域相互作用，其重链互补决定区（CDRs）在与 GAD65 的结合中起主导作用。特别是 CDR H3，它插入到 apoGAD65 的 α7 和 α9 螺旋之间，与260PEVKEK265基序形成广泛的盐桥相互作用，成为连接 GAD65 二聚体关键结构元件的重要桥梁。
在研究结论和讨论部分，研究人员指出，holoGAD65 和 apoGAD65 的构象存在明显差异，holoGAD65 通过氢键网络维持相对稳定的构象，而 apoGAD65 在失去 PLP 后，多个区域的灵活性增加。催化环在 GAD65 的构象变化中起着关键作用，它不仅与 CTD 存在动态关联，还参与了酶的催化反应和自身失活过程。此外，研究还发现，GAD65 的自身抗原性与其构象灵活性密切相关，b96.11 抗体能够识别并结合 GAD65 上的关键区域，这些区域的构象变化可能影响了 GAD65 的自身抗原性。与非抗原性的 GAD67 相比，GAD65 独特的内在构象灵活性在其自身抗体反应中起着关键作用。
总的来说，这项研究详细地描绘了 GAD65 的动态特征以及它与疾病相关自身抗体的相互作用机制。研究结果表明，GAD65 的自身抗原性与其内在的构象灵活性紧密相连，而这种构象灵活性又决定了其酶自身失活的机制。这一发现为过去三十年的免疫学数据提供了结构上的合理解释，进一步加深了我们对 GAD65 在自身免疫疾病中作用的分子理解，为未来开发针对自身免疫疾病的治疗策略提供了重要的理论基础。
