揭秘细菌 “护盾”：Tol-Pal 复合物在革兰氏阴性菌外膜脂质稳态中的关键作用

在革兰氏阴性菌中，外膜（OM）的稳定至关重要，但 Tol-Pal 复合物在维持 OM 脂质稳态和细胞分裂中的作用难以区分。新加坡国立大学研究人员构建嵌合复合物开展研究，发现该复合物能维持 OM 脂质稳态，确定其主要功能，为理解细菌生理机制提供关键依据。

　　在微观的细菌世界里，革兰氏阴性菌凭借其独特的外膜（Outer Membrane，OM）在复杂环境中 “披荆斩棘”。这层外膜如同坚固的 “护盾”，不仅维持着细胞包膜的完整性，还充当抵御外界侵害的屏障，像抗生素这类 “外敌” 都难以轻易突破。它由脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）、蛋白质和磷脂（Phospholipids，PLs）等精心组装而成，各成分协同合作，确保外膜的稳定和功能正常。但长期以来，科学家们对这些成分如何精准平衡，从而实现外膜脂质稳态的机制知之甚少。

Tol-Pal 复合物一直被认为在维持外膜稳定性方面发挥着重要作用，可它就像一个神秘的 “多面手”，在细胞分裂过程中也扮演着角色，而且会定位于细胞隔膜，这使得研究人员很难确定它在维持外膜脂质稳态中的具体功能。由于缺乏清晰认知，面对细菌相关疾病时，科学家们在寻找有效干预策略上困难重重，这就迫切需要深入研究来解开 Tol-Pal 复合物的 “神秘面纱”。

为了攻克这一难题，新加坡国立大学（National University of Singapore）的研究人员 Wee Boon Tan 和 Shu-Sin Chng 勇挑重担，开启了这场探索之旅。他们巧妙地构建了一种嵌合复合物，通过改造让它失去在隔膜处的富集特性，从而将 Tol-Pal 复合物在维持外膜脂质稳态和细胞分裂中的功能分离开来进行研究。经过一系列严谨的实验，他们发现这个外周定位的 Tol-Pal 复合物依旧能够出色地维持外膜脂质平衡，有力地证明了 Tol-Pal 复合物的主要功能是介导革兰氏阴性菌的外膜脂质稳态，且这一功能与细胞分裂过程无关。这一重大发现为深入理解细菌生理机制点亮了一盏明灯，在抗菌药物研发、传染病防治等领域都有着不可估量的潜在价值。该研究成果发表在《Nature Communications》上，引起了科学界的广泛关注。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。基因工程技术，他们借助 λ Red 重组工程构建基因缺失等位基因，利用 Gibson 组装法构建表达相关蛋白的质粒；微生物培养技术，在不同条件的 Luria-Bertani（LB）培养基中培养菌株，通过控制温度、添加抗生素和诱导剂等，精准调控菌株生长；检测分析技术，采用效率平板实验检测菌株对 SDS/EDTA、万古霉素和低盐环境的敏感性，通过周质 RNase 泄漏试验检测外膜完整性，运用显微镜技术观察细胞形态和荧光定位，利用 OMV 定量、PagP 介导的 LPS 七酰化分析和 OM 脂质组成分析等方法研究外膜脂质稳态相关指标。

研究结果如下：

• TonB^TM-TolA 融合蛋白的功能特性：研究人员假设 Tol-Pal 通过反向 PL 运输维持外膜完整性且不依赖隔膜定位，为此构建了 TonB^TM-TolA 嵌合体与 ExbBD 复合物共同作用。实验发现，在 ΔtolQRA 背景菌株中表达 TonB^TM-TolA，能使其对 SDS/EDTA 和万古霉素产生强抗性，有效阻止周质内容物泄漏，表明该融合蛋白可恢复外膜屏障功能；但在细胞分裂方面，它无法挽救 ΔtolQRA 突变体在低渗透压下的生长和细胞链状分裂缺陷，说明其不能替代 TolQRA 参与隔膜细胞壁重塑和外膜内陷过程。
• 嵌合复合物的定位与 Pal 蛋白的定位变化：通过对 N 端标记 sfGFP 的 TonB^TM-TolA 进行细胞定位研究发现，与正常定位在细胞分裂位点的 sfGFP-TolA 不同，sfGFP-TonB^TM-TolA 随机分布在细胞周边，这表明与 ExbBD 相互作用的 TonB^TM-TolA 失去了隔膜定位特性。进一步研究 Pal 蛋白定位时发现，在 ΔtolQR 背景下，ExbBD-TonB^TM-TolA 复合物无法恢复隔膜处 Pal-mCherry 的富集，由此推断表达该复合物菌株的细胞分裂缺陷是由于隔膜定位的 Tol-Pal 功能丧失。此外，研究还意外发现表达 ExbBD-TonB^TM-TolA 可恢复 tol-pal 突变体在正常渗透压下的细胞形态缺陷，说明该缺陷可能源于外膜脂质代谢紊乱。
• 外周定位复合物对 OM 脂质稳态的维持作用：tol-pal 突变体通常会释放过量的外膜囊泡（Outer Membrane Vesicles，OMVs），研究人员发现表达 ExbBD-TonB^TM-TolA 可使 ΔtolQRA 菌株的 OMV 产生量显著降低，减少约 79% ，这表明外周定位的 Tol-Pal 功能足以显著减轻 OM 过度囊泡化现象。在脂质分析实验中，ΔtolQRA 突变体表现出 PL:LPS 比值升高和七酰化 LPS 水平增加，而表达 TonB^TM-TolA 可使这些分子表型恢复到野生型水平，重新建立外膜脂质稳态。

研究结论和讨论部分指出，该研究成功将 Tol-Pal 复合物在维持外膜脂质稳态和细胞分裂中的功能分离，明确了其在维持外膜脂质稳态中的主要作用。这一成果不仅解释了 tol-pal 突变体的多种表型，还为深入理解细菌外膜生理机制提供了关键依据。尽管目前还不清楚 Tol-Pal 复合物如何介导外膜稳定性，但基于研究结果推测其可能通过反向 PL 运输发挥作用。此外，Tol-Pal 复合物在细胞分裂过程中也具有重要意义，可能参与调节隔膜处的膜曲率和脂质组成变化。未来，研究人员将聚焦于阐明 Tol-Pal 复合物在维持外膜脂质稳态和内陷过程中的具体分子机制，这有望为抗菌药物研发和传染病防治开辟新的道路，推动生命科学和健康医学领域的进一步发展。