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研究人员针对现有基因检测技术的不足，开展基于 LAMP 的基因变异检测研究，结果显示该方法特异性和敏感性高，有望革新基因检测。
在生命科学和医学领域，基因检测就像一把精准的 “钥匙”，能帮助我们打开疾病诊断和治疗的大门。尤其是在精准医疗时代，通过检测基因变异，医生可以为患者制定更加个性化的治疗方案，大大提高治疗效果。然而，目前的基因检测方法却存在不少 “绊脚石”。传统的检测技术，如下一代测序、桑格测序和多重实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）等，不仅操作流程复杂，需要先进的实验室设备、专业的软件和经过严格训练的操作人员，而且检测成本高昂。更麻烦的是，这些方法还需要进行侵入性的组织采样，给患者带来额外的痛苦和风险，并且难以实现自动化检测和即时检测（POCT），这使得许多患者无法及时获得准确的检测结果，延误了最佳治疗时机。
为了攻克这些难题，来自 Genomtec SA 和弗罗茨瓦夫医科大学的研究人员 Aneta Cierzniak、Ma?gorzata Ma?odobra - Mazur 和 Miron Tokarski 展开了深入研究。他们将目光聚焦在环介导等温扩增反应（Loop - mediated isothermal amplification，LAMP）技术上，试图开发一种更高效、便捷的基因变异检测方法。这项研究成果发表在《Scientific Reports》上，为基因检测领域带来了新的曙光。
研究人员开展的这项研究主要基于 LAMP 技术。该技术与传统 PCR 不同，它在整个扩增阶段只需要一个稳定的温度，具有反应时间短、成本低、对抑制剂耐受性强等优点，非常适合用于即时检测。研究人员对 LAMP 技术进行改良，通过修饰引物，使 F2 或 B2 引物的 3’端对突变序列具有特异性，从而实现只在存在基因变异时才产生扩增产物，避免了野生型 DNA 的干扰。
在研究过程中，研究人员用到了几个关键的技术方法。首先，他们使用合成的基因片段 gBlocks? Gene Fragments 作为模板，模拟人类 EGFR 基因的特定突变；同时，从健康供体的血液中提取野生型人类 DNA 作为背景和阴性对照。其次，精心设计引物，对 F2 或 B2 引物的 3’端进行修饰，使其与目标变异序列互补。最后，利用实时荧光定量 LAMP（Real - Time LAMP）技术进行扩增反应，并通过熔解曲线分析来检测扩增产物。
下面来看看具体的研究结果：
- 方法的敏感性和特异性：研究人员通过使用一系列稀释的合成模板，检测该方法对不同 EGFR 基因突变的敏感性。结果显示，该方法能够检测到最低 250 拷贝目标序列的多种 EGFR 基因突变，包括 NM_005228.5 (EGFR):c.2235_2249del (p.Glu746_Ala750del)、NM_005228.5 (EGFR):c.2240_2254del (p.Leu747_Thr751del) 等。在检测特异性时，使用健康人提取的人类遗传物质（野生型）和无核酸酶水（NTC）作为对照，结果显示这些样本中均未出现扩增产物，证明了该方法的引物对目标基因变异具有高度特异性。
- FIP/BIP 引物在 LAMP 扩增反应机制中的作用：研究人员通过设置有 FIP 或 BIP 引物和无 FIP 或 BIP 引物的反应，来分析它们在 LAMP 反应中的作用。结果发现，只有在反应混合物中存在所有引物时，才会观察到扩增产物，缺少 FIP 或 BIP 引物时则无扩增产物，这表明 FIP 和 BIP 引物在 LAMP 反应中都起着至关重要的作用，且 BIP 引物与 FIP 引物功能相似，只是作用于前导链。
- 引物修饰能力的评估：为了确定 F2 引物中与变异后核酸序列相同的核苷酸的最佳数量，研究人员设计了 7 种不同的引物，对其 3’端进行不同长度的修饰。结果表明，F2 引物修饰 1 个核苷酸时，无法特异性检测基因变异；而修饰 2 - 7 个核苷酸时，则能够特异性检测基因变异，有效区分野生型 DNA 和变异基因序列。
- B2 引物修饰用于突变检测的验证：研究人员设计了带有特定突变的合成模板 gBlock?，验证 B2 引物修饰能否用于突变检测。结果显示，使用修饰后的 B2 引物，能够检测到目标突变，证明了 B2 引物修饰也可以促进基因变异的特异性检测。
- 引物在突变和野生型 DNA 混合物中的特异性：考虑到肿瘤样本通常包含突变和健康细胞的混合物，研究人员评估了设计的引物在野生型 DNA 存在下对突变 DNA 的特异性。实验结果表明，即使在野生型 DNA 存在且变异等位基因频率（VAF）低至 0.1% 的情况下，引物仍能特异性地检测到突变 DNA。
研究结论和讨论部分指出，LAMP 技术具有检测多种基因变异的潜力，其简单、快速、低成本的特点，使其无需复杂设备和专业人员操作，非常适合用于即时检测。而且，该技术可以使用多种生物样本，包括液体活检样本，简化了检测流程，大大提高了检测效率。与目前市场上的其他检测技术，如定量 PCR（qPCR）和下一代测序（NGS）相比，基于 LAMP 技术的新方法在检测限（LOD）、检测时间（TTR）和即时检测能力等方面具有明显优势，检测限可低至 0.01% VAF，检测时间小于 45 分钟，且能够实现即时检测。这一研究成果为基因变异检测提供了一种更高效、便捷的解决方案，有望在肿瘤学及其他需要检测基因变异的诊断领域得到广泛应用，推动精准医疗的发展，为患者带来更好的治疗效果和生存希望。
