探秘 ALS-FTLD：C9ORF72 突变下线粒体 DNA 突变的 “神秘旅程”

为探究 mtDNA 突变在 ALS - FTLD 发病机制中的作用，研究人员用 hiPSCs - 衍生脑类器官研究，发现 C9ORF72 突变星形胶质细胞 mtSNV 负担高，或助力靶向治疗。

　　

# 揭开肌萎缩侧索硬化症与额颞叶痴呆背后的 “基因密码”：线粒体 DNA 突变的新发现
在神经科学的神秘领域中，肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）和额颞叶痴呆（Frontotemporal Lobar Degeneration，FTLD）一直是令科学家们着迷又困惑的难题。ALS 患者会逐渐失去对肌肉的控制，仿佛身体被无形的力量禁锢；FTLD 患者则会出现认知和行为的异常，曾经熟悉的世界变得陌生而混乱。大约 20% 的 ALS 和 FTLD 患者是由基因问题导致的，其中 C9ORF72 基因的六核苷酸重复扩增是最常见的原因。但奇怪的是，尽管这个基因突变存在于患者的每一个细胞中，相关的神经病理变化却只在特定区域出现，这背后的原因一直是个谜。

同时，研究发现 ALS - FTLD 患者大脑中，线粒体 DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）突变的负担增加，这暗示着线粒体机制可能在疾病发生中起着重要作用。然而，这些突变是如何产生的、何时出现的，仍然是未解之谜。为了揭开这些谜团，来自国外的研究人员开展了一项深入的研究，相关成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上。

研究人员采用了人类诱导多能干细胞（Human - Induced Pluripotent Stem Cells，hiPSCs）衍生的脑类器官技术，这种技术就像是在实验室里搭建了一个微型的 “大脑工厂”，能够模拟大脑的发育和细胞间的相互作用。研究人员选取了携带 C9ORF72 六核苷酸重复扩增的 ALS - FTLD 患者的 hiPSCs，同时设置了 CRISPR - Cas9 基因编辑校正的同基因对照和健康对照。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）分析，筛选出特定的细胞标记物，以此来鉴定和分离脑类器官中的星形胶质细胞（astroglia）和神经元（neurons）。接着，对分离出的单细胞进行 mtDNA 测序，深入分析 mtDNA 突变的情况。为确保数据的准确性和可靠性，研究人员还使用了数字液滴聚合酶链反应（ddPCR）来测量单细胞的 mtDNA 含量 。

1. 分离脑类器官中的星形胶质细胞和神经元

研究人员最初研究了四个 hiPSC 系，包括两个携带 C9ORF72 突变的 ALS - FTLD 患者来源的细胞系（als - ftld.a 和 als - ftld.b）、一个 CRISPR - Cas9 校正的同基因对照细胞系（ctrl.a）以及一个健康对照细胞系（ctrl.b）。经过 133 天的培养，这些脑类器官展现出相似的细胞类型多样性和细胞结构。通过单细胞 RNA 测序实验的特征图，证实了星形胶质细胞中肝和神经胶质细胞粘附分子（HEPACAM）、水通道蛋白 4（AQP4）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和谷氨酸天冬氨酸转运体（GLAST 或 SLC1A3）的表达；在神经元中，深层皮质神经元表达 L1 细胞粘附分子（L1CAM）、COUP - TF 相互作用蛋白 2（CTIP2）或 B 细胞淋巴瘤 / 白血病 11B（BCL11B），上层皮质神经元表达富含 AT 序列结合蛋白 2（SATB2）和同源框蛋白 Cut 样 2（CUX2）。利用针对星形胶质细胞标记物（HEPACAM）和神经元标记物（L1CAM）的免疫反应性，通过荧光激活细胞分选（FACS）技术，成功从 133 天的脑类器官中分离出星形胶质细胞和神经元。

2. 单细胞 mtDNA 突变负担和异质性水平

研究人员对来自四个 hiPSC 系和两个脑类器官的 206 个单细胞进行了重复测序（分为运行 1 和运行 2）。为了减少测序误差，研究人员使用经过验证的生物信息学方法，识别出在运行 1 和运行 2 中异质性分数（HF）均超过 0.005（0.5%）的 mtDNA 单核苷酸变异（mtSNV）。结果发现，对照 hiPSC 中每个细胞平均检测到 8 个 mtSNV，而 C9ORF72 突变的 hiPSC 中每个细胞平均检测到 10 个（als - ftld.a）和 14 个（als - ftld.b），且突变细胞的累积 HF 更高，突变的平均致病性概率也更高。在 133 天的脑类器官中，来自突变校正同基因对照器官的星形胶质细胞每个细胞平均检测到 15 个 mtSNV，神经元中为 29 个；而 C9ORF72 突变器官的星形胶质细胞每个细胞平均检测到 19 个 mtSNV，神经元中为 26 个。C9ORF72 突变器官的星形胶质细胞 HF 更高，且其 mtDNA 突变更具致病性。

3. mtSNV 的起源

研究发现，对照 hiPSC 和类器官衍生细胞之间，有 36.64% 的 mtSNV 是重叠的（共享 mtSNV），63.35% 只存在于 hiPSC 中（丢失 mtSNV）；在 C9ORF72 突变体中，14.90% 是共享 mtSNV，85.09% 是丢失 mtSNV。共享和丢失的 mtSNV 突变特征相似，基于共享和新出现的 mtSNV 的层次聚类分析表明，共享 mtSNV 可能在 CRISPR 校正后不久发生并经过克隆扩增，而新出现的 mtSNV 则发生在更晚阶段。

4. 类器官皮质发生过程中对共享 mtSNV 的选择

尽管类器官衍生细胞的突变负担增加，但无论是对照 hiPSC 还是 C9ORF72 突变 hiPSC 来源的星形胶质细胞和神经元中，mtSNV 的 HF 都显著降低。这表明在脑类器官的形成和成熟过程中，hiPSC 中存在的大量 mtSNV 被负向选择。进一步研究发现，这种选择在神经元中比在星形胶质细胞中更明显，在 C9ORF72 突变器官的细胞中比在同基因对照器官的细胞中更明显。

5. 可能的新生 mtSNV

C9ORF72 突变器官的星形胶质细胞中，每个细胞的新生 mtSNV 数量比神经元以及同基因对照器官的两种细胞类型都多。这些突变更多地定位在编码呼吸链复合物的 mtDNA 区域和蛋白质编码区域，且被预测为致病性突变。此外，C9ORF72 突变的星形胶质细胞与对照相比，具有更高的时钟样特征和 DNA 错配修复缺陷，更接近神经元的突变特征。

6. 脑类器官中 mtSNV 的克隆起源

研究人员分析了脑类器官中 mtSNV 的 HF 和克隆分布。结果显示，共享 mtSNV 的 HF 最高，新出现的 mtSNV 的 HF 较低。C9ORF72 突变的星形胶质细胞中，高 HF 的 mtSNV 定义了一个独特的进化枝，且许多高 HF 的 mtSNV 位于复合物和核糖体 RNA 编码区域，超过了传统的致病性阈值频率（HF > 0.6）。此外，神经元的 mtDNA 拷贝数高于星形胶质细胞，而 C9ORF72 突变细胞的 mtDNA 拷贝数低于同基因对照，尤其是突变的星形胶质细胞。

研究结果表明，C9ORF72 突变的星形胶质细胞中积累了最多的新生 mtSNV，这些突变更有可能影响线粒体功能。mtDNA 含量在 C9ORF72 突变的星形胶质细胞中相对较低，这可能会加剧病理效应。该研究不仅揭示了 mtDNA 突变在 ALS - FTLD 发病机制中的重要作用，还为理解疾病的区域病理提供了新的视角，为开发线粒体靶向治疗开辟了道路。同时，研究中发现的细胞类型和谱系特异性的 mtDNA 突变差异，也解释了 hiPSC 衍生细胞系研究结果缺乏可重复性和普遍性的原因。这一研究成果为神经科学领域研究 ALS - FTLD 带来了新的曙光，有望推动相关疾病治疗手段的进一步发展。