沙门氏菌利用 LRRK2 依赖的质膜动态入侵宿主细胞：揭示感染新机制与疾病关联

在探究沙门氏菌（Salmonella）入侵宿主细胞机制的问题上，研究人员开展了关于 Salmonella 利用宿主细胞 LRRK2 激酶相关质膜（PM）动态过程的研究。结果发现 LRRK2 通过磷酸化 RAB10GTPase形成膜库助力 Salmonella 入侵，且疾病相关 LRRK2 变异体可抑制入侵。这为理解感染机制和疾病防治提供新视角。

　　在微观的细胞世界里，一场悄无声息的 “战争” 时刻都在上演，主角之一便是沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，STm）。它作为一种兼性细胞内细菌病原体，常常引发食源性肠胃炎，严重威胁人类健康。一直以来，科学家们都在努力探寻它入侵宿主细胞的奥秘，可其中的机制却错综复杂，很多关键环节仍未被完全揭示。比如，虽然已知 Salmonella 会利用 III 型分泌系统（T3SSs）将毒力因子注入宿主细胞来引发感染，但在这个过程中，宿主细胞的膜动态变化以及相关蛋白的调控机制还存在诸多谜团。正是在这样的背景下，来自加拿大多家研究机构（如 Hospital for Sick Children、University of Toronto 等）的研究人员开展了深入研究，试图揭开这些神秘的面纱。
研究人员通过一系列实验，得出了一系列重要结论。这些结论不仅让我们对 Salmonella 的入侵机制有了更清晰的认识，还为相关疾病的防治开辟了新的思路。该研究成果发表在《Nature Communications》上，引起了科学界的广泛关注。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是基因编辑技术，利用 CRISPR/Cas9 工具构建了 LRRK2_KO、TLR4_KO和 TMEM16F_KO等基因敲除细胞系，以此来探究相关基因在 Salmonella 感染过程中的功能；其次是细胞感染实验，用野生型和突变型的 STm 感染不同的细胞系，观察细胞的变化；最后是多种成像技术，如共聚焦显微镜、扫描电子显微镜等，用于观察细胞内蛋白定位、膜结构变化以及细菌入侵情况。
下面来详细介绍研究结果：

1. LRRK2 通过 RAB10 磷酸化生成膜库：研究人员通过蛋白质免疫印迹实验发现，在正常生长条件下，Henle 407 人肠上皮细胞中的 RAB10 在苏氨酸 - 73（T73）位点存在显著磷酸化，使用 LRRK2 激酶选择性抑制剂（MLi-2）处理细胞后，RAB10^T73磷酸化水平下降。免疫荧光显微镜观察显示，磷酸化的 RAB10 定位于膜小管。进一步实验表明，LRRK2 激酶活性通过 RAB10 磷酸化与 RAB10⁺小管的动态变化密切相关，RAB10 的 T73 位点磷酸化对于膜库的形成既是必要的也是充分的。
2. LRRK2 依赖的膜库被 STm 在入侵过程中利用：在 STm 感染过程中，研究人员观察到磷酸化的 RAB10 在感染后 10 分钟会富集到 STm 入侵位点，且 RAB10 是以磷酸化和 GTP 结合的形式被招募到入侵位点的。通过扫描电子显微镜和细胞内菌落形成单位（CFU）计数实验发现，LRRK2_KO细胞的入侵褶皱尺寸显著减小，细菌入侵能力下降，这表明 LRRK2 通过 RAB10^T73磷酸化生成的膜库可被 STm 利用来促进其入侵。
3. RAB10 去磷酸化是 STm 入侵位点质膜分裂所必需的：在 STm 入侵过程中，质膜在入侵褶皱底部内陷，然后分裂形成含沙门氏菌的液泡（SCVs）。研究人员发现，RAB10 在感染后 10 - 30 分钟会从入侵位点去除，且是以去磷酸化和 GDP 结合的形式被去除的。通过质膜分裂实验表明，RAB10 的去磷酸化对于 SopD 介导的 RAB10 从入侵位点的去除以及细菌进入 SCVs 是必要的。
4. 疾病相关的 LRRK2 变异体通过阻止 RAB10 去磷酸化抑制 STm 入侵：编码 LRRK2 激酶结构域的变异体与克罗恩病（CD）和帕金森病（PD）的发生风险增加有关。研究人员发现，疾病相关的 LRRK2 变异体 G2019S 和 N2081D 会导致 RAB10 在基础生长条件下磷酸化水平升高，且在 STm 入侵过程中，这些变异体能够阻止 RAB10 去磷酸化，进而抑制 STm 入侵。
5. TLR4 介导 STm 入侵过程中 RAB10 的去磷酸化：研究人员发现，除了 STm 的 SPI - 1 T3SS 效应蛋白外，细菌的脂多糖（LPS）也能诱导 RAB10 去磷酸化。通过构建 TLR4_KO细胞系发现，TLR4 在 STm 入侵过程中通过感知 LPS 刺激，诱导 RAB10 在入侵位点去磷酸化，从而促进细菌摄取。
6. PIEZO1 通过 RAB10 去磷酸化调节入侵位点的质膜动态：PIEZO1 作为一种机械敏感离子通道，研究发现它的激活对于触发 TLR4 依赖的 RAB10 去磷酸化既是必要的也是充分的。PIEZO1 的激活剂 Yoda1 处理细胞可降低 RAB10^T73磷酸化水平，抑制剂处理则会抑制 RAB10 去磷酸化。PIEZO1 在 STm 入侵过程中调节质膜动态，影响细菌入侵。
7. TMEM16F 是局部磷脂酰丝氨酸翻转和 LRRK2 从 STm 入侵位点去除所必需的：TMEM16F 是一种钙激活的磷脂翻转酶，研究发现它在 STm 入侵过程中被招募到入侵位点，且对于局部磷脂酰丝氨酸（PS）翻转到质膜外小叶是必需的。同时，TMEM16F 还能促进 LRRK2 从入侵位点去除，影响 RAB10 磷酸化和 DNM2 的招募。
   研究结论和讨论部分指出，LRRK2 在调节质膜动态方面起着关键作用，它通过磷酸化 RAB10 形成膜库，膜库在 STm 入侵时可被动员形成入侵褶皱促进细菌摄取。之后，RAB10 需要去磷酸化，以便 SopD 介导其从入侵位点去除，从而实现质膜分裂和细菌进入 SCVs。此外，疾病相关的 LRRK2 变异体虽然与 PD 和 CD 等疾病的发生有关，但在面对 STm 等病原体时，可能通过干扰 RAB10 的磷酸化过程，增强宿主对细菌感染的防御能力。这一研究揭示了 Salmonella 入侵宿主细胞的新机制，为理解 LRRK2 在宿主防御和疾病发生中的双重作用提供了重要依据，有助于开发针对 Salmonella 感染以及相关疾病的新治疗策略。