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本文揭示顶端 - 基底极性（apical-basal polarity）决定胰腺 Neurogenin3?内分泌祖细胞（EPs）向 α 或 β 细胞分化命运，为相关研究提供新视角。
引言
在细胞和发育生物学领域，一个关键问题是细胞外信号如何在动态变化的微环境中调控多能祖细胞的分化。胰腺作为一种由内胚层发育而来的腺体器官，其内分泌细胞的分化机制一直是研究热点。在胰腺发育过程中，多能胰腺祖细胞的命运受到多种因素影响，其中细胞间黏附和机械信号传导等已被证实发挥重要作用。然而，对于内分泌祖细胞（EPs）向不同内分泌细胞类型分化的具体机制，尤其是向 α 和 β 细胞分化的命运决定机制，仍有待深入探究。
此前研究发现，所有内分泌亚型细胞在发育过程中都经历一个表达 NEUROG3 的阶段，NEUROG3 是内分泌祖细胞程序的关键调控因子。但 NEUROG3?细胞如何分化为五种不同的内分泌细胞类型，特别是 α 和 β 细胞的命运决定机制尚不明确。有研究观察到，在小鼠发育早期，胰腺上皮大多未极化时，激活内分泌程序主要产生 α 细胞；而在晚期，当祖细胞微环境更为复杂且更多 EPs 获得顶端 - 基底极性时，β 细胞的产生增加。基于这些发现，研究人员推测细胞黏附和顶端 - 基底细胞极性之间可能存在联系，进而影响 NEUROG3?细胞向 α 和 β 细胞谱系的命运决定。
结果
- 细胞间黏附与人类 EP 微环境中的顶端 - 基底极性和细胞命运相关：为验证小鼠研究中细胞间黏附对 α 和 β 细胞特化的作用在人类 EP 微环境中是否同样适用，研究人员构建了过表达显性负性 E-cadherin（CDH1）突变体（CDH1ΔE 和 CDH1ΔP）的人类胚胎干细胞（hESC）系。通过强力霉素（Dox）诱导突变体表达，降低上皮细胞间的黏附强度。结果显示，表达突变体的 hESCs 失去上皮形态，且在模拟体内上皮微环境的 Matrigel 覆盖培养系统中，分化细胞形成的微腔减少，β 细胞与 α 细胞的比例显著降低。这表明降低细胞间黏附会干扰人类 EP 微环境中的顶端 - 基底极性，使细胞更倾向于向 α 细胞命运分化。
- 破坏发育中小鼠胰腺的顶端 - 基底极性会改变内分泌细胞的特化：研究人员利用条件性 Cdc42 敲除小鼠，分析顶端 - 基底极性在体内对 EPs 向 α 和 β 细胞命运的调控作用。Cdc42 敲除导致胰腺上皮顶端 - 基底极性、管腔扩张和整体内分泌发生严重紊乱。在 E16.5 的敲除小鼠胰腺中，β 细胞数量显著减少，而 α 细胞数量不变，β 细胞与 α 细胞的比例降低。这说明破坏小鼠胰腺上皮的顶端 - 基底极性会抑制 β 细胞分化，但对 α 细胞分化无影响。
- 人类 EPs 动态变化的顶端 - 基底极性状态影响 α 与 β 细胞的命运：研究人员通过对人类胎儿胰腺组织和 Matrigel 覆盖 hESC 模型的研究发现，EPs 的顶端 - 基底极性状态在分化过程中动态变化。在 9.9 周的人类胎儿胰腺中，可观察到数量大致相等的极化和非极化 EPs。在 Matrigel 覆盖培养系统中，随着培养时间延长，顶端膜含量增加，且在第 10 - 13 天，NEUROG3?/EGFP?细胞中具有顶端（EZR?）膜结构域的细胞数量在第 13 天明显多于第 10 天。通过调整分化方案，同步诱导早期和晚期 EPs 产生，结果显示晚期诱导的 EPs 产生的 β 细胞与 α 细胞比例更高，表明 EPs 在分化早期处于极化状态的时间越短，越容易向 α 细胞分化；而在更成熟、极化的上皮环境中产生的 EPs 更倾向于分化为 β 细胞。
- 顶端 - 基底极化的人类 EPs 倾向于成为 β 细胞：研究人员发现 Prominin-1（PROM1，CD133）是 Matrigel 覆盖培养系统中顶端膜 / 管腔的特异性标记物，且在人类胎儿胰腺组织中，PROM1 仅在顶端膜结构域表达，并与其他顶端标记物共定位。利用这一特性，通过流式细胞术对 EPs 进行分选，将分选后的 PROM1?和 PROM1? EPs 分别培养并检测其分化情况。结果显示，来源于 PROM1? EPs 的激素?细胞群体中，β 细胞与 α 细胞的比例比来源于 PROM1? EPs 的群体高出两倍以上，表明极化的 EPs 更倾向于分化为 β 细胞。
- 单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）揭示极化 EPs 的分化倾向：为深入了解 EPs 顶端 - 基底极性状态与命运分配之间的联系，研究人员对早期诱导、晚期诱导、PROM1?晚期非极化和 PROM1?晚期极化的 EPs 进行 scRNA-seq 分析。通过细胞索引转录组和表位测序（CITE-seq）技术，将单细胞转录谱与细胞的原始特征（顶端 - 基底极化和内分泌诱导时间）相关联。结果发现，大多数 α 细胞由非极化 EPs 产生，而 β 细胞主要来源于晚期诱导的极化 EPs。同时，分析还发现一些与 β 细胞分化相关的基因，如 DLK1、CHGA 和 INS 在晚期诱导和极化的 EP 特征中表达上调，但敲低 DLK1 并不影响 EPs 向 α 或 β 细胞的分化。
- 顶端 - 基底极性通过抑制 ARX 表达促进 β 细胞命运：通过对非极化与极化 EPs 的 scRNA-seq 数据筛选，并结合先前已发表的预 β 和预 α 细胞 scRNA-seq 数据，研究人员发现 ARX 基因在非极化 EPs 和早期 α 细胞中表达上调，且其表达与 α 细胞的产生相关。免疫细胞化学、定量实时 PCR 和流式细胞术等实验证实，ARX 在早期 EPs 中不表达，后期表达增加，且与 GCG 的表达密切相关。此外，PROM1? EPs 中 ARX 的表达高于 PROM1? EPs，抑制 cadherin 功能会增加 ARX 表达，表明非极化状态的 EPs 维持 ARX 表达。
- 顶端 - 基底极性通过 cAMP 信号通路调节 ARX 表达：为探究顶端 - 基底极性调节 ARX 表达的机制，研究人员进行了计算机转录因子（TF）基序分析，发现 Early growth response 1（EGR1）是唯一在极化与非极化 EPs 中差异表达且能结合 ARX 基因座的转录因子。EGR1 在 PROM1? EPs 中的表达高于 PROM1? EPs，敲低 EGR1 会导致 ARX 表达增加，β 细胞与 α 细胞的比例降低。进一步研究发现，cAMP / 蛋白激酶 A（PKA）-cAMP 反应元件结合蛋白（CREB）信号通路可增强 EGR1 基因转录，且 PROM1 可能通过调节该信号通路来影响 ARX 表达。实验表明，用 cAMP 激动剂 forskolin（FSK）和 3 - 异丁基 - 1 - 甲基黄嘌呤（IBMX）处理 EP 阶段细胞，可增加 cAMP 水平，促进 EGR1 表达，抑制 ARX 表达，进而提高 β 细胞与 α 细胞的比例。
讨论
在哺乳动物胚胎发育早期，顶端 - 基底极性在细胞命运决定中发挥重要作用，如在胚胎内细胞团和滋养外胚层的初始谱系分配中起关键作用。在器官发生过程中，多能上皮祖细胞的顶端 - 基底极性与组织重塑和命运决定之间存在相互调控关系。然而，顶端 - 基底极性是否控制多能神经祖细胞的后续命运决定仍不清楚。本研究明确了顶端 - 基底极性在 EPs 向 β 和 α 细胞谱系命运分配中的直接作用，即顶端 - 基底极性通过 cAMP/PKA-CREB-EGR1 介导的 ARX 表达抑制，促进 β 细胞特化；而非极化 EPs 中 cAMP 水平降低，维持 ARX 表达，导致 α 细胞分化。
在小鼠中，Pax4 通过抑制 Arx 促进 β 细胞形成，但在人类中，PAX4 对 β 细胞特化并非关键。ARX 在小鼠和人类中对 α 和 β 细胞发育的影响存在差异，在小鼠中敲除 ARX 会增加 β 细胞数量，而在人类中则减少 β 细胞数量。这表明不同物种间内分泌细胞发育的调控机制存在差异。
本研究还发现，cAMP/PKA-CREB 信号通路与 β 和 α 细胞特化相关的转录机制之间的关键联系由 EGR-1 和 ARX 介导。虽然在 EPs 中表达的 GPCRs 在极化和非极化 EPs 中无差异表达，但 PROM1 可能通过调节 cAMP/PKA-CREB 信号通路来影响 ARX 表达。由于 EPs 在极化和非极化状态之间动态转换，且 cAMP 半衰期较短，推测只有当顶端 - 基底极性稳定时，PROM1/EZR 蛋白才能使 cAMP/PKA-CREB 信号通路的所有组件在顶端膜上靠近，从而激活该通路，诱导 β 细胞特化。
本研究强调了对多能祖细胞微环境进行时间分析的重要性，包括对其细胞生物学特征的研究，这有助于识别每种命运诱导事件的独特信号。研究人员期望对其他器官（如肺、脑和乳腺）中的多能祖细胞进行动态分析，能够为识别相应器官中命运诱导的外在信号提供帮助。
研究的局限性
尽管研究表明 EPs 在细胞解离后仍保留顶端 - 基底极性，但细胞解离和分选过程可能会改变细胞的原始状态，从而影响 CITE-seq 分析结果。此外，虽然在小鼠体内证实了顶端 - 基底极性在 α 和 β 细胞命运中的作用，但尚未完全验证这一观察结果在体内是由 cAMP/PKA-CREB-EGR1-ARX 信号通路介导的。
资源可用性
