不同膜模拟物对 ABC 转运蛋白 MsbA 结构影响的系统分析

本文通过冷冻电镜（cryo-EM）分析 12 种膜模拟物对 ABC 转运蛋白 MsbA 的影响，揭示其结构和功能差异。

　　

研究背景

ATP 结合盒（ABC）转运蛋白在 ATP 的作用下，通过在向内（IF）和向外（OF）两种构象之间的显著变化，实现底物跨脂质双层的运输。解析其结构对于理解运输机制至关重要，冷冻电镜单颗粒分析是常用的研究方法，而该方法需要将目标蛋白从质膜纯化，并在人工膜模拟物中稳定分离的蛋白颗粒。目前有多种膜模拟物可供选择，如传统的基于膜支架蛋白（MSPs）的纳米圆盘、去污剂（如洋地黄皂苷、麦芽糖苷等）、两亲性聚合物、基于 saposin 或肽的纳米圆盘等。不同膜模拟物各有优缺点，且对膜蛋白的活性、稳定性和构象谱有显著影响。

ABC 转运蛋白 MsbA 在革兰氏阴性菌中负责将粗糙型脂多糖（LPS）翻转穿过内膜至周质，对细菌的生存和抗生素抗性至关重要。其构象谱存在广泛争议，不同研究方法得到的结果差异较大，且其活性受脂质环境影响显著，因此 MsbA 是研究膜蛋白对不同膜模拟物结构响应的理想模型。

研究方法

研究人员利用冷冻电镜单颗粒分析技术，系统比较了处于无核苷酸状态的 ABC 转运蛋白 MsbA 在 12 种不同环境中的构象谱。具体步骤如下：

1. 蛋白表达与纯化：将携带 His 标记的 MsbA 的 pET - 19b 质粒转化到大肠杆菌 C41 (DE3) 细胞中，诱导表达后，通过超声破碎细胞，离心收集膜 fraction。用不同去污剂溶解膜 fraction，经镍亲和层析和透析等步骤纯化蛋白。
2. 膜模拟物重构
   • 肽盘重构：将纯化的 MsbA 与 Ni - NTA 珠子孵育，再加入肽进行重构，最后洗脱得到重构的 MsbA。
   • 纳米圆盘重构：表达并纯化膜支架蛋白（MSPs），将其与磷脂和纯化的 MsbA 按一定比例混合，通过生物珠去除胆酸盐，经尺寸排阻色谱分离得到重构的纳米圆盘。
   • A8 - 35 重构：将纯化的 MsbA 与 Amphipol A8 - 35 按比例混合，孵育后经生物珠处理和尺寸排阻色谱纯化。
   • 直接提取：用 Amphipol 18 直接从膜 fraction 中提取蛋白，再经纯化得到用于实验的样品。
3. ATP 酶活性测定：采用钼酸盐比色法测定不同膜模拟物中 MsbA 的 ATP 酶活性，通过检测反应释放的磷酸盐量来评估活性。
4. 冷冻电镜样品制备与数据采集：将样品滴加到辉光放电处理的 C - flat 多孔碳网格上，在特定条件下进行 blotting 和 vitrification。使用配备 Falcon 4 直接电子探测器和 Selectris 能量过滤器的 200 kV Glacios 透射电子显微镜收集图像。
5. 数据处理与模型构建：使用 CryoSPARC 软件对收集的电影进行处理，包括运动校正、CTF 估计、粒子挑选、2D 和 3D 分类以及重构等步骤。利用 ModelAngelo、UCSF Chimera 和 Coot 等软件进行模型构建和优化，并用 Phenix 软件进行精修和验证。

研究结果

1. 不同膜模拟物对 MsbA 构象的影响：去污剂和 Amphipol 18 等能直接从膜中提取蛋白的环境，通常有利于 IF_wide构象；而大多数纳米圆盘重构样品中，MsbA 主要呈现 IF_narrow构象。例外的是大尺寸的 MSP2N2 纳米圆盘，其中 30% 的 MsbA 颗粒显示 IF_wide构象。LMNG 和 GDN 中则同时存在 IF_narrow和 IF_wide构象，且分布均匀。
2. 构象分类与测量：通过测量两个对称氨基酸对（E506 和 D512）之间的距离来分类不同的 NBD 分离程度。在去污剂中，通常观察到宽开放的 IF 构象，NBD 分离范围为 58 - 78 ?；而在纳米圆盘和肽盘中，NBD 距离变窄。改变脂质组成似乎不影响 MsbA 的开放程度，但带蛋白的大小会影响构象谱，较大的 MSP2N2 纳米圆盘允许 IF_wide构象存在，NBD 分离为 60 ?。
3. 脂质结合情况：比较纳米圆盘和去污剂稳定的 MsbA 的高分辨率结构，发现两者结合的脂质数量没有显著差异。MsbA 与纳米圆盘的带蛋白直接相互作用或通过蛋白 - 脂质 - 蛋白相互作用，并非在纳米圆盘中自由漂浮。
4. ATP 酶活性与构象的关系：纳米圆盘中 MsbA 的 ATP 酶活性普遍高于去污剂，但活性与构象之间没有明显的相关性。例如，MSP1D1 纳米圆盘中 MsbA 活性最高，而在具有大 NBD 分离的 Amphipol 中活性最低。在所有去污剂溶解的样品中，除 UDM 外，活性相似，与检测到的构象无关。肽盘中的 ATP 酶活性与去污剂中的相当，但低于 MSP 基纳米圆盘。
5. LPS 前体的结合：在所有 IF_narrow构象中都存在结合的 LPS 前体，而在 IF_wide构象中，LPS 前体的密度在低阈值下才可见，难以进行模型构建和定量分析。

研究讨论

1. 膜蛋白对环境的结构响应：已有研究表明多种膜蛋白对不同疏水环境有显著结构响应，MsbA 是其中的典型例子。本研究通过对 MsbA 在 12 种膜模拟物中的构象反应研究，发现纳米圆盘样品多为窄 IF 构象，去污剂则倾向于宽 IF 构象，且 CMC 与 NBD 分离程度相关。
2. LPS 前体与构象的关系：只有 IF_narrow状态的细胞内门含有清晰的 LPS 前体密度，IF_wide构象更灵活，结合口袋扩大，可能导致 LPS 结合模式多样或占有率不完全，从而在平均化过程中丢失信号，且某些去污剂可能导致 LPS 去除。
3. ATP 酶活性的影响因素：MsbA 的 ATP 酶活性受多种因素影响，包括 NBS 距离、脂质存在和去污剂的抑制作用等。虽然 IF_narrow构象中 NBS 距离短有利于二聚化，脂质也对活性有促进作用，但具体机制仍需进一步研究。
4. 膜模拟物的选择：不同的科学问题需要选择不同的膜模拟物环境。MSP2N2 纳米圆盘能提供高活性和功能构象谱，但图像处 理难度大；LMNG 虽活性低，但处理效率高，成本效益好。研究结果为研究人员选择合适的膜模拟物提供了参考。

研究结论

本研究系统分析了 12 种膜模拟物对 MsbA 的结构和功能影响，揭示了不同膜模拟物导致的结构和功能偏差，强调了在膜蛋白结构测定和解释中考虑这些因素的重要性。研究结果为其他膜蛋白的研究提供了参考，有助于深入理解膜蛋白与膜模拟物之间的相互作用，推动膜蛋白研究领域的发展。