单细胞外囊泡检测法发现膜结合型 α- 突触核蛋白：帕金森病早期诊断的新希望

帕金森病（PD）早期诊断困难，本文介绍一种芯片上液滴限制荧光报告检测法，可识别血清中 L1CAM?细胞外囊泡（EVs）膜上的 α- 突触核蛋白。研究发现其在病理条件下增加，是 PD 早期诊断的潜在生物标志物，为 PD 诊断带来新方向。

　　### 研究背景
帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是常见的运动障碍疾病，有较长的前驱期，期间会出现一些非运动症状。PD 的病理特征是 α- 突触核蛋白（α-synuclein）在神经元内聚集。目前 PD 的诊断主要依赖临床评估主要运动症状，这给早期检测以及与 PD 样疾病的区分带来挑战，且缺乏可靠的血液检测方法来识别潜在病理。

细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）是由所有细胞类型分泌的膜性纳米颗粒，可进入体循环，有望成为生物标志物的丰富来源。其中，L1CAM? EVs（L1EVs）被认为可反映神经细胞的稳态，在神经退行性疾病生物标志物研究中备受关注。此前研究虽发现 L1EVs 中 α- 突触核蛋白与 PD 相关，但现有检测方法存在样本需求量大、仪器复杂等问题。因此，开发高灵敏度、可用于临床的检测平台至关重要。

实验方法

1. 微流控数字免疫分析：构建微流控芯片，利用差压驱动生成皮升尺度液滴，每个液滴可包裹单个免疫捕获的 EV，并标记生物素化抗体，结合链霉亲和素 -β- 半乳糖苷酶（SβG）和荧光素底物（fluorescein-di-β-D-galactopyranoside，FDG）进行酶催化荧光成像。通过优化实验条件，如确定合适的珠子浓度、反应时间和珠子与 EV 的比例等，实现对单个 EV 膜蛋白的准确测量。
2. 样本处理与检测：从血清和细胞培养上清（Conditioned media，CM）中分离 EVs，采用尺寸排阻色谱法（SEC）、免疫捕获法等进行处理。使用多种抗体，如针对 α- 突触核蛋白不同构象的抗体（A17183A、LB509 等）、通用 EV 标记物抗体（CD9、CD81 等）以及神经元或免疫细胞标记物抗体（L1CAM、NCAM、CD11b 等），通过微流控芯片检测 EV 膜蛋白表达情况，并结合纳米流式细胞术（NanoFCM）、直接随机光学重建显微镜（dSTORM）、免疫印迹、MSD 电化学发光等技术进行验证。
3. 细胞实验与动物模型：在 SH-SY5Y 细胞中表达野生型（WT）或 PD 相关突变型 α- 突触核蛋白（A53T、E46K 等），并构建 α- 突触核蛋白基因（SNCA）三倍体（SNCA^TRIP）的人诱导多能干细胞（iPSC）来源的多巴胺能神经元模型，收集 CM 进行 EV 分析，探究 α- 突触核蛋白与 L1EV 膜结合在病理条件下的变化。
4. 临床样本分析：收集牛津发现队列中年龄和性别匹配的孤立性快速眼动睡眠行为障碍（iRBD）患者、PD 患者和健康对照（HCs）的血清样本，采用盲法进行处理和分析，评估 L1EV 膜结合型 α- 突触核蛋白作为生物标志物的临床效用。

实验结果

1. 微流控免疫分析的性能：微流控芯片可高效生成单分散的皮升大小液滴，平均直径为 27.9μm，在 1mL 活塞抽取体积下可产生约 200,000 个液滴，约 10% 的液滴含有荧光编码磁珠及单个 EV 免疫复合物。该平台能准确检测低丰度的 EV 亚型，检测限（LOD）为 66 CD81? L1EVs/μL，定量限（LOQ）为 112 CD81? L1EVs/μL，动态范围为 66 - 8,307 CD81? L1EVs/μL，且可实现对不同 EV 亚群膜蛋白的多重检测。
2. α- 突触核蛋白与 EV 膜的关联：通过实验证实 α- 突触核蛋白可与血清 EV 膜结合，且在 L1EVs 上更为富集。使用不同抗体检测发现，潜在聚集形式的 α- 突触核蛋白在 CD9? EVs 中有一定比例，而总 α- 突触核蛋白在 L1CAM? EVs 上的检测比例更高。经 SEC 处理排除游离 α- 突触核蛋白干扰后，dSTORM 进一步确认 α- 突触核蛋白在血清 EV 表面的定位。
3. 病理条件下 α- 突触核蛋白与 L1EV 膜结合的变化：在细胞实验中，表达 PD 相关突变型 α- 突触核蛋白的细胞，其 L1EV 膜结合型 α- 突触核蛋白水平增加，且与细胞内 α- 突触核蛋白水平及突变对脂质结合的影响有关。在 iPSC 衍生的神经元模型中，SNCA^TRIP神经元来源的 L1EVs 中膜结合型 α- 突触核蛋白水平比同基因对照（SNCA^ISO）增加约 2 倍。
4. 临床样本中 L1EV 膜结合型 α- 突触核蛋白的诊断价值：对临床样本分析发现，iRBD 或 PD 患者血清中 L1EV 膜结合型 α- 突触核蛋白水平高于 HCs。以 α- 突触核蛋白 / CD81 比值调整 EV 数量差异后，诊断性能进一步提高，区分 iRBD 与对照的受试者工作特征曲线下面积（AUC）为 0.93，区分 PD 患者与对照的 AUC 为 0.95，且该比值与之前测量的 L1EV 总 α- 突触核蛋白水平相关。

讨论

本研究建立的微流控平台可在单 EV 分辨率下超灵敏检测和定量 EV 膜结合蛋白，具有检测限低、速度快、操作简单、可多重检测等优势，能更详细地反映 EV 异质性。研究发现膜结合型 α- 突触核蛋白可作为 PD 早期诊断的生物标志物，且在 iRBD 阶段即可检测到，优于之前的批量检测方法。然而，目前尚不清楚检测到的信号在多大程度上反映了生理 α- 突触核蛋白在 EV 表面的错误定位或其组装成具有不同抗体结合亲和力的病理构象，仍需进一步研究。此外，本研究存在一定局限性，如受荧光图像采集和处理速度限制，分析的输入珠子比例较低，影响了检测灵敏度，未来可通过自动化图像采集和量化或集成芯片上 EV 免疫捕获等技术改进。总体而言，本研究为 PD 早期诊断提供了新的方向和潜在生物标志物，有助于推动临床筛查测试的发展。