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本文揭示了钙传感器蛋白 OsCBL1 通过调节 OsNLP4 的核质穿梭调控 OsNRT1.1B 表达，影响水稻氮磷信号协调。
一、引言
在植物生长的过程中，营养平衡就像是一把精准的尺子，对植物的健康生长和产量起着至关重要的作用。每一种营养元素在植物的各个生长阶段都有着特定的比例要求，多一分或者少一分都可能影响植物的生长状态。为了维持良好的生长态势，植物进化出了一套神奇的机制，能够感知和整合各种营养信号，从而协调自身对营养元素的吸收和利用，避免出现营养过剩或不足的情况。
氮（N）和磷（P）作为植物生长发育过程中不可或缺的关键营养元素，它们之间的相互配合对植物的影响尤为显著。合适的氮磷供应比例，就像是给植物注入了一剂 “生长加速剂”，能够极大地促进植物生长，提高作物产量。早期研究发现，增加氮的供应能够推动磷酸盐转运蛋白基因的转录，进而促进植物对磷的吸收和积累。然而，植物究竟是如何整合氮和磷信号，以实现氮磷营养的最佳平衡，这一分子机制在很大程度上仍然是一个未解之谜。
硝酸盐在植物体内扮演着 “双重角色”，它不仅是植物获取氮元素的主要来源，还是一种至关重要的信号分子。它能够影响植物多个发育过程相关基因的表达，在多条代谢途径中触发营养响应。近年来，科学家们在硝酸盐信号和响应的研究领域取得了不少进展，发现了许多关键因子。比如在拟南芥中，AtNRT1.1/CHL1 既能作为硝酸盐转运体，又能充当传感器，通过 Thr101 的磷酸化开关来识别硝酸盐浓度的变化。在水稻中，与 AtNRT1.1 同源的基因 OsNRT1.1B 同样具有硝酸盐传感功能，有助于硝酸盐信号的转导。NIN-LIKE PROTEIN 家族（NLPs）转录因子则能通过与硝酸盐响应顺式元件结合，激活相关基因表达，从而调控氮信号和同化过程。在水稻里，OsNLP4 作为 AtNLP7 的同源基因，在硝酸盐的刺激下，能够从细胞质转移到细胞核，并直接调节与氮吸收、同化和信号传导相关基因的表达。不过，水稻中的这一过程是否依赖于 Ca2+信号通路，目前还不清楚。
磷酸盐同样既是植物生长必需的营养物质，也是一种信号分子，参与调控基因表达和营养响应。在水稻中，OsPHR2 对 PSI 基因的表达上调起着关键作用，而 OsSPX4 则是 PSI 基因表达的抑制因子。在磷酸盐充足的情况下，OsSPX4 蛋白能够感知高浓度的磷酸盐，并与 OsPHR2 直接相互作用，阻止其进入细胞核；而在低磷酸盐条件下，OsSPX4 会通过 26S 蛋白酶体降解，使得 OsPHR2 能够进入细胞核，激活 PSI 基因表达。此外，其他 SPX 蛋白，如 OsSPX1、OsSPX2 和 OsSPX6 等，也能通过阻碍 OsPHR2 与靶基因的结合或进入细胞核，来抑制其功能。这些研究充分表明了 SPXs - PHR2 模块在植物磷酸盐信号传导中的重要性。
近期研究还揭示了硝酸盐和磷酸盐信号之间存在着密切的相互作用。在拟南芥中，AtNIGT1 受 AtPHR1 和 AtNLP 的调控，参与了磷和氮营养调控的转录级联反应，建立了两者之间的直接联系。AtNIGT1 蛋白还能通过直接结合 SPX 启动子抑制其表达，从而在磷酸盐饥饿信号响应中激活 PHR。在水稻中，OsNRT1.1B - OsSPX4 模块在氮磷信号传导中发挥着关键作用。然而，在 OsNRT1.1B - OsSPX4 模块上游，植物感知和传递氮磷信号的分子机制依旧不明确。此前研究表明，Ca2+传感器蛋白 OsCBL1 参与了氮磷信号传导，影响水稻幼苗生长，但具体的分子机制尚未明晰。本研究发现，降低水稻中 OsCBL1 的表达会减少硝酸盐诱导的 Pi 饥饿反应相关基因的表达，影响高硝酸盐条件下高磷促进的生长效应。同时，在 OsCBL1 敲低植株中，氮磷信号的关键抑制因子 OsSPX4 因 OsNRT1.1B 表达降低而在硝酸盐存在时保持稳定，并且 OsCBL1 的敲低还阻碍了硝酸盐相关转录因子 OsNLP4 从细胞质向细胞核的转运，进而导致 OsNRT1.1B 表达下降。这一系列结果表明，OsCBL1 通过调节 OsNLP4 的亚细胞定位来调控 OsNRT1.1B 的表达，为深入理解植物氮磷信号通路的协调机制提供了新的视角。
二、结果
（一）硝酸盐可通过激活磷酸盐信号促进磷的利用
氮磷营养的均衡供应是作物茁壮成长、实现高产的关键因素。为了探究氮磷在植物生长过程中的内在联系，研究人员选用野生型（WT）水稻，在四种不同的硝酸盐和磷酸盐供应条件下进行培养，分别是高氮高磷、高氮低磷、低氮高磷以及低氮低磷。实验结果令人惊讶地发现，只有在高硝酸盐和高磷酸盐共同供应的情况下，野生型水稻才会呈现出生长加快、生物量增加的现象；而当硝酸盐供应处于低水平时，即便磷酸盐供应充足，水稻也无法获得生长上的促进。这一现象有力地证明了硝酸盐在激活植物对磷的利用过程中起着不可或缺的作用。
为了进一步探究硝酸盐的作用机制，研究人员开展了一项短期硝酸盐诱导实验，旨在确定硝酸盐是否作为一种信号分子，刺激磷酸盐响应基因的表达。实验结果显示，与氯化钾处理组相比，经过短期硝酸盐处理后，多个 PSI 基因，如 OsPT2、OsPT6、OsIPS2、OsPT3、OsPT8、OsPT9、OsPT10 和 OsPT13 等，都出现了表达上调的情况。这充分表明硝酸盐能够直接触发与磷酸盐饥饿信号相关的基因表达，从而促进植物的生长。
（二）敲低 OsCBL1 会损害硝酸盐诱导的磷酸盐信号
前期研究已经初步表明，OsCBL1 通过调节氮磷信号来影响水稻幼苗的生长。在本研究中，研究人员首先对不同硝酸盐和磷酸盐供应条件下 OsCBL1 的表达情况进行了评估，结果发现它的表达会随着氮磷水平的变化而做出相应的调整。为了深入探究其背后的分子机制，研究人员对野生型和 OsCBL1 - KD 植株中硝酸盐诱导的 PSI 基因转录水平进行了细致的检测。对比发现，敲低 OsCBL1 后，硝酸盐诱导的 PSI 基因表达显著降低，这一结果明确了 OsCBL1 在硝酸盐触发的磷酸盐信号传导中起着关键作用。
研究人员还将 OsCBL1 - KD 植株在不同的氮磷供应条件下进行培养，结果发现，在所有条件下，OsCBL1 - KD 植株的生物量增长都明显低于野生型植株。有趣的是，即使在高硝酸盐条件下，额外添加磷酸盐也无法像在野生型植株中那样，使 OsCBL1 - KD 植株的生物量显著增加。而野生型植株在高硝酸盐和高磷酸盐条件下，生物量会大幅提升。这些结果进一步证实了 OsCBL1 在介导植物对硝酸盐诱导的磷酸盐信号响应以及维持氮磷利用平衡方面的重要作用，充分凸显了硝酸盐触发的磷酸盐信号对 OsCBL1 的依赖性。
（三）敲低 OsCBL1 会损害硝酸盐触发的 OsSPX4 降解
先前的研究已经证实，OsSPX4 是硝酸盐诱导的磷酸盐信号传导中的关键抑制因子，并且硝酸盐处理能够促进其下游蛋白 OsSPX4 的降解。为了探究 OsCBL1 与 OsSPX4 在硝酸盐诱导的磷酸盐信号通路中是否存在潜在联系，研究人员开展了荧光素酶活性测定实验，以评估野生型和 OsCBL1 - KD 水稻原生质体中 OsSPX4 蛋白的稳定性。实验结果显示，在硝酸盐诱导的条件下，与野生型相比，OsCBL1 - KD 植物原生质体中 OsSPX4 - 萤火虫荧光素酶（fLUC）的降解受到了显著阻碍。
研究人员还利用 eGFP 标记的 OsSPX4，在水稻原生质体中观察其积累情况。在野生型水稻原生质体中，暴露于硝酸盐后，OsSPX4 - eGFP 的荧光强度明显降低；而在 OsCBL1 - KD 原生质体中，氯化钾处理组和硝酸钾处理组的荧光强度并没有显著差异。此外，在硝酸钾处理后，OsCBL1 - KD 植株中 PSI 基因的表达相较于野生型有所降低。这些研究结果进一步强化了硝酸盐诱导的磷酸盐反应依赖于 OsCBL1 的观点，同时也表明敲低 OsCBL1 会阻碍硝酸盐诱导的 OsSPX4 降解，进而对硝酸盐触发的磷酸盐信号通路产生影响。
（四）敲低 OsCBL1 会降低 OsNRT1.1B 的表达
上述实验结果表明，OsCBL1 在硝酸盐诱导的磷酸盐信号传导中，可能通过 OsSPX4 介导的途径发挥作用。然而，酵母双杂交实验（Y2H assays）显示，OsCBL1 与 OsSPX4 之间不存在直接相互作用，这意味着 OsCBL1 并非直接激活 OsSPX4 的降解。已有研究表明，硝酸盐感知能够增强 OsNRT1.1B 与 OsSPX4 的相互作用，从而促进 OsSPX4 的降解；在 nrt1.1b 突变体中，这种硝酸盐诱导的 OsSPX4 降解会受到抑制。基于此，研究人员推测在 OsCBL1 - KD 植株中，OsNRT1.1B 与 OsSPX4 之间可能存在某种调控联系。
通过对比野生型和 OsCBL1 - KD 植株中 OsNRT1.1B 的转录水平，研究人员发现，在不同的硝酸盐和磷酸盐供应条件下，OsCBL1 - KD 植株中 OsNRT1.1B 的表达均有所下降，这表明 OsCBL1 位于 OsNRT1.1B 的上游，对其表达起着调控作用。为了评估 OsNRT1.1B 转录水平降低对 OsSPX4 降解的影响，研究人员在水稻原生质体中进行了一项改良的荧光素酶活性测定实验，以 OsSPX4 - fLUC 作为报告基因。实验结果显示，与对照组相比，随着 OsNRT1.1B 量的增加，荧光信号显著降低，这表明 OsNRT1.1B 表达的降低会阻碍 OsSPX4 的降解。综合这些结果可以看出，OsCBL1 参与了硝酸盐诱导的磷酸盐信号传导，并且可能是通过 OsNRT1.1B - OsSPX4 模块来实现这一过程的。
（五）OsCBL1 通过改变 OsNLP4 的细胞质 - 细胞核穿梭来调节 OsNRT1.1B 的表达
为了深入探究 OsCBL1 - KD 植株中 OsNRT1.1B 表达下调的内在机制，研究人员将目光聚焦于调控 OsNRT1.1B 表达的转录因子。先前的研究指出，NIN - LIKE PROTEIN 家族（NLPs）中的 OsNLP4 在氮信号传导和同化过程中扮演着关键角色，并且它能够直接与 OsNRT1.1B 的启动子结合；在 osnlp4 突变体中，OsNRT1.1B 的表达会下调。基于这些发现，OsNLP4 成为了研究人员重点关注的对象。
研究人员将由 OsNRT1.1B 启动子控制的报告基因 fLUC，与用于表达 OsNLP4 的效应质粒共同转染到原生质体中。实验结果显示，共表达 OsNLP4 能够增强 OsNRT1.1B 启动子的活性，这进一步证实了 OsNLP4 对 OsNRT1.1B 表达具有正向调控作用。
虽然在 OsCBL1 - KD 植株中 OsNRT1.1B 的表达降低，但研究人员并未观察到 OsCBL1 - KD 和野生型植株中 OsNLP4 转录水平存在显著差异。转录因子通常定位于细胞核中，在那里发挥对下游基因表达的调控作用。已有研究表明，硝酸盐的存在能够促进水稻中 OsNLP4 向细胞核的转运，在拟南芥中，AtNLP7 响应硝酸盐进入细胞核的过程依赖于 Ca2+传感器蛋白激酶。这些研究结果暗示，Ca2+传感器蛋白 OsCBL1 可能对 OsNLP4 的细胞质 - 细胞核转运也至关重要。
为此，研究人员在硝酸盐供应条件下，对野生型和 OsCBL1 - KD 原生质体中 OsNLP4 的亚细胞定位进行了检测。结果发现，在氯化钾处理时，野生型和 OsCBL1 - KD 水稻原生质体中 OsNLP4 - eGFP 的定位没有明显差异；但在暴露于硝酸盐后，野生型原生质体中的 OsNLP4 - eGFP 仅存在于细胞核中，而在 OsCBL1 - KD 原生质体中，它同时存在于细胞质和细胞核中。这一结果表明，在 OsCBL1 - KD 植株中，硝酸盐诱导的 OsNLP4 从细胞质向细胞核的转移受到了抑制。结合之前 OsNLP4 能够增加 OsNRT1.1B 表达的实验结果，研究人员推测，OsCBL1 可能通过控制硝酸盐诱导的 OsNLP4 的细胞质 - 细胞核穿梭，来调节 OsNRT1.1B 的表达。
三、讨论
在植物的生长历程中，硝酸盐和磷酸盐具有双重身份，它们既是植物生长各阶段不可或缺的氮源和磷源，又能作为信号分子，精准调控基因表达，引发营养响应。过往研究显示，Ca2+传感器蛋白 OsCBL1 参与硝酸盐信号传导，敲低 OsCBL1 会改变硝酸盐和磷酸盐响应基因的表达，这意味着 OsCBL1 很可能是硝酸盐和磷酸盐信号通路之间相互交流的 “协调者”。
为了深入探究其中的分子机制，研究人员对不同氮磷供应条件下 OsCBL1 - KD 和野生型植株的生长特性进行了对比研究。结果发现，在高硝酸盐和高磷酸盐条件下，OsCBL1 - KD 植株的生物量并未像野生型植株那样显著增加，而且经过短期硝酸盐处理后，OsCBL1 - KD 植株中硝酸盐诱导的磷酸盐饥饿诱导（PSI）基因的表达相较于野生型有所降低。这些结果突出了 OsCBL1 在协调氮磷信号方面的关键作用，也表明下调 OsCBL1 会削弱植物对硝酸盐诱导的磷酸盐信号的响应能力，最终抑制在高硝酸盐和高磷酸盐环境下的生物量积累，为深入理解硝酸盐诱导的磷酸盐信号通路的调控机制提供了新的线索。
氮磷的协同利用对于实现作物的可持续高产意义重大。在水稻中，当硝酸盐浓度较低时，细胞质中的抑制蛋白 OsSPX4 会与转录因子 OsNLP3 和 OsPHR2 紧密结合，阻止它们进入细胞核，进而抑制氮磷响应基因的表达；而在硝酸盐浓度升高时，硝酸盐转运体 OsNRT1.1B 会与 OsSPX4 以及泛素连接酶 OsNBIP1 相互作用，形成 OsNRT1.1B - OsSPX4 - OsNBIP1 复合物，该复合物能够介导 OsSPX4 的泛素化和降解，使得 OsNLP3 和 OsPHR2 得以进入细胞核，激活氮磷响应基因的转录，从而促进营养元素的平衡利用，提高养分利用效率。
在本次实验中，研究人员观察到在硝酸盐缺乏的条件下，OsCBL1 - KD 植株中的 PSI 基因表达下调；同时，在 OsCBL1 - KD 原生质体中，硝酸盐诱导的 OsSPX4 降解受到明显抑制；此外，在各种条件下，OsCBL1 - KD 植株中 OsNRT1.1B 的转录活性都显著降低，导致 OsSPX4 降解减少。这些结果表明，OsCBL1 在水稻中可能通过调节 OsNRT1.1B - OsSPX4 模块，在整合氮磷信号方面发挥着关键作用，一旦其功能异常，就会打破氮磷平衡。这一发现为寻找维持氮磷营养平衡的 OsNRT1.1B - OsSPX4 模块的上游调控因子提供了重要线索。
钙传感器蛋白 OsCBL1 并不会直接调控 OsNRT1.1B 的表达。已有研究表明，NLP 转录因子能够与基因启动子中的 NRE 元件结合，从而调节 NRT 基因的表达。在水稻中，OsNLP1、OsNLP3 和 OsNLP4 都能直接与 OsNRT1.1B 启动子中的 NRE 元件相互作用。其中，OsNLP3 和 OsNLP4 会在硝酸盐的诱导下从细胞质转移到细胞核，而 OsNLP1 则始终定位于细胞核中。此前研究还发现，OsSPX4 与 OsNLP3 的相互作用会抑制 OsNLP3 进入细胞核。
在本研究中，OsCBL1 - KD 植株中硝酸盐诱导的 OsSPX4 降解缺失，这可能使得 OsNLP3 因与 OsSPX4 结合而滞留在细胞质中。研究人员对 OsNLP4 进行了亚细胞定位分析，结果发现，在 OsCBL1 - KD 植株中，硝酸盐诱导的 OsNLP4 从细胞质向细胞核的转运受到了阻碍。这表明，在高硝酸盐条件下，OsCBL1 通过调节 OsNLP4 的细胞内运动来调控 OsNRT1.1B 的表达，进而稳定 OsSPX4，阻止 OsNLP3 和 OsPHR2 进入细胞核，最终导致氮磷相关基因的表达降低。不过，OsCBL1 控制 OsNLP4 从细胞质向细胞核转运的具体机制，还有<>
先前研究表明，OsNRT1.1B - OsSPX4 模块参与了硝酸盐触发的磷酸盐信号传导以及磷酸盐介导的硝酸盐响应过程。鉴于 OsCBL1 在硝酸盐触发的磷酸盐信号传导中的作用，推测它可能也参与了通过磷酸盐对硝酸盐响应的调控。在野生型植株中，磷酸盐水平的变化会根据硝酸盐浓度的不同，对硝酸盐响应基因（如 OsNRT2.1、OsNIR1 和 OsNIA1）的表达产生不同影响：在低硝酸盐条件下，高磷酸盐会使这些基因表达上调；而在高硝酸盐条件下，高磷酸盐则会使其表达下调。然而，在 OsCBL1 - KD 植株中，其对高磷酸盐的响应明显减弱。这说明 OsCBL1 在介导氮磷相互作用方面起着关键作用，但其具体的调控机制仍有待进一步深入探究。
按照常理，OsCBL1 - KD 植株中 OsNRT1.1B 表达下调，会使硝酸盐含量降低，因为 OsNRT1.1B 是硝酸盐转运体。但实际情况却恰恰相反，在不同的硝酸盐和磷酸盐条件下，敲低 OsCBL1 反而使硝酸盐含量增加。研究人员进一步研究发现，敲低 OsCBL1 会通过抑制 OsCCA1 的表达，上调硝酸盐转运体基因 OsNRT2.2 的表达，从而导致硝酸盐含量上升。这表明 OsCBL1 能够调控多个硝酸盐转运体基因的表达，精细调节这些基因的表达对于水稻积累氮元素至关重要。尽管 OsCBL1 - KD 植株中硝酸盐含量较高，但由于 OsSPX4 无法正常降解、PSI 基因诱导较弱，以及高磷酸盐无法促进生长等现象，与 osnrt1.1b 突变体的表型一致。由此可见，OsCBL1 一方面通过调节 OsNLP4 的运动来响应硝酸盐诱导的磷酸盐信号，调控 OsNRT1.1B 的表达；另一方面，它还独立调控 OsNRT2.2 的表达来促进硝酸盐积累，这是两条相对独立的调控途径。
四、结论
本研究成功揭示了一个重要的调控机制：敲低 OsCBL1 会打乱水稻在硝酸盐刺激下，OsNLP4 在细胞质与细胞核之间的穿梭过程。这一变化使得 OsNRT1.1B 的表达量下降，进而通过稳定 OsSPX4，对硝酸盐诱导的磷酸盐反应产生显著影响。这一发现为探寻维持水稻氮磷营养平衡的 OsNRT1.1B - OsSPX4 模块的上游调控因子提供了全新的线索，有力地凸显了 OsCBL1 在优化水稻氮磷养分利用方面的潜在重要价值，为未来水稻栽培中合理调控氮磷营养、提高作物产量和品质奠定了坚实的理论基础。
