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为解决半胱氨酸抑制微生物细胞生长及影响其生产的问题，研究人员对谷氨酸棒杆菌进行研究，发现 ilvN 基因突变可缓解抑制，且突变株半胱氨酸产量提升。
在生命的微观世界里，氨基酸的作用至关重要。半胱氨酸（Cysteine）作为一种含硫氨基酸，凭借其抗氧化特性，在食品、化妆品和制药等多个行业都有着广泛应用。然而，它却有着 “双面性”，在发挥功效的同时，还会抑制微生物细胞的生长。
在微生物发酵生产半胱氨酸的过程中，这个问题尤为突出。当半胱氨酸浓度升高，微生物的生长速度就会明显下降，这不仅导致细胞数量减少，还使得半胱氨酸的生产效率大打折扣。以往的研究虽然对其抑制生长的现象有所了解，但背后的具体机制却一直模糊不清。为了攻克这一难题，来自日本东京理科大学（Institute of Science Tokyo）的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology 》上。
研究人员采用了多种关键技术方法。首先是适应性实验室进化（ALE）技术，通过在含有半胱氨酸的培养基中反复传代培养谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），筛选出能够抵抗半胱氨酸抑制作用的突变菌株。其次，利用全基因组重测序技术，精确找出与半胱氨酸抗性相关的基因突变位点。此外，还运用了 PCR 技术对特定基因进行扩增和突变引入，以及采用多种分析技术，如定量 PCR（qPCR）分析基因表达、高效液相色谱法测定氨基酸浓度、酶活性测定法检测乙酰羟酸合酶（AHAS）活性等，从不同层面深入探究半胱氨酸抑制生长的机制以及突变菌株的特性。
下面来看看具体的研究结果：
- 半胱氨酸对谷氨酸棒杆菌生长的影响：研究发现，半胱氨酸对谷氨酸棒杆菌野生型菌株 NBRC 12168 的生长具有明显的抑制作用，而且这种抑制作用呈现出剂量依赖性。当培养基中添加的 L - 半胱氨酸盐酸盐一水合物（Cys?HCl?H?O）浓度在 0.25 - 1g/L 时，随着浓度增加，菌株在指数生长期的比生长速率逐渐降低。而 aecD 基因（编码半胱氨酸脱硫酶，负责半胱氨酸降解）敲除菌株对半胱氨酸更为敏感，即使在低浓度（0.25g/L）的 Cys?HCl?H?O 存在下，其生长也会受到显著抑制。
- 谷氨酸棒杆菌在半胱氨酸存在下的 ALE 实验：研究人员以 aecD 基因敲除菌株为起始材料，进行了 5 个独立的 ALE 实验系列。经过 2200 - 2300 小时（相当于 330 - 370 代）的培养，最终在含有 4g/L Cys?HCl?H?O 的改良 M9 培养基中观察到细胞生长，且比生长速率达到约 0.13h?1。从 ALE 培养物中分离出的突变菌株，如 ALE2_10_3、ALE5_2_9 和 ALE5_10_4，在含有 4g/L Cys?HCl?H?O 的培养基中能够良好生长，证实了其半胱氨酸抗性。
- 谷氨酸棒杆菌半胱氨酸抗性突变体的分离及相关突变鉴定：通过对 ALE 培养物进行筛选，研究人员获得了多个半胱氨酸抗性突变体。对这些突变体和 ALE 培养物细胞群体进行全基因组重测序分析，发现 ilvN（NCgl1223）基因发生了突变。ilvN 基因编码 AHAS 的调节小亚基，参与支链氨基酸的生物合成。在不同的突变体中，检测到如 S41P、V15I 和 D17E 等不同的 ilvN 基因突变。
- 支链氨基酸对谷氨酸棒杆菌在半胱氨酸存在下生长的影响：研究表明，ilvN 基因突变与谷氨酸棒杆菌中缬氨酸形成增加有关。添加缬氨酸能够缓解半胱氨酸对谷氨酸棒杆菌 aecD 基因敲除菌株的生长抑制作用，且随着缬氨酸添加量的增加，生长改善效果更明显。而亮氨酸只能轻微改善生长，异亮氨酸则几乎没有作用。进一步研究发现，ilvN 基因中的 S41P 和 D17E 突变是谷氨酸棒杆菌对半胱氨酸产生抗性的主要原因。
- ilvN 基因突变对谷氨酸棒杆菌氨基酸生产的影响：对 ilvN 基因突变的 aecD 基因敲除菌株进行氨基酸分析，发现除了缬氨酸产量增加外，亮氨酸产量也有所增加，但低于缬氨酸的产量。此外，还检测到甘氨酸的产生，而组氨酸的产生则受到抑制，这表明 ilvN 基因突变可能对多种氨基酸的生物合成产生影响。
- katA 基因与缬氨酸缓解生长抑制作用的关系：由于半胱氨酸可通过芬顿反应（Fenton reaction）诱导氧化应激，研究人员推测缬氨酸可能通过诱导过氧化氢酶（由 katA 基因编码）的合成来减轻半胱氨酸的生长抑制作用。然而，实验结果表明，添加缬氨酸和 ilvN 基因突变均未显著影响 katA 基因的表达，且在 katA 基因敲除的情况下，缬氨酸仍能缓解半胱氨酸的生长抑制作用，说明该缓解作用与氧化应激无关。
- 半胱氨酸对谷氨酸棒杆菌 AHAS 活性的影响：实验测定发现，半胱氨酸会抑制谷氨酸棒杆菌 aecD 基因敲除菌株中 AHAS 的活性，当添加 0.1g/L Cys?HCl?H?O 时，AHAS 活性降低约 40%。而含有突变 IlvN 蛋白（如 S41P、D17E 和 V15I 突变）的 AHAS 对半胱氨酸具有抗性，即使在半胱氨酸存在的情况下，仍能保留较高的活性。
- 工程化半胱氨酸抗性突变体的半胱氨酸生产：将携带突变 cysE 和 serA 基因的质粒 pCYS*_Cg(T94A)-SER*导入半胱氨酸抗性突变体中，构建半胱氨酸生产菌株。结果显示，虽然突变体转化后的细胞生长低于 aecD 基因敲除菌株转化体，但半胱氨酸产量却更高，表明半胱氨酸抗性是谷氨酸棒杆菌生产半胱氨酸的有效表型。
综合研究结论和讨论部分，此次研究揭示了谷氨酸棒杆菌中半胱氨酸抑制生长的机制与支链氨基酸（尤其是缬氨酸）的生物合成受阻密切相关。ilvN 基因突变不仅能够缓解半胱氨酸的生长抑制作用，还能提高半胱氨酸的生产能力。这一研究成果为微生物发酵生产半胱氨酸及相关产品提供了重要的理论依据和实践指导，有助于优化生产工艺，提高生产效率，推动相关产业的发展。同时，研究中发现的其他可能与半胱氨酸抗性相关的基因和机制，也为后续深入研究提供了新的方向。
