蛋白质二硫键异构酶（PDI）：成骨细胞分化及骨骼发育的关键调控因子

为探究 PDI 在骨生物学中的作用，研究人员构建小鼠模型，发现其对成骨细胞分化和骨形成至关重要。

　　在骨骼的发育过程中，成骨细胞起着至关重要的作用，它们就像一群勤劳的 “建筑工人”，不断合成和分泌各种物质，构建起坚固的骨骼结构。而蛋白质二硫键异构酶（Protein disulfide isomerase，PDI）作为一种存在于内质网中的氧化还原酶，以往的研究发现它与多种疾病相关，在糖尿病、心血管疾病、癌症等领域都有它的 “身影”。在骨生物学方面，虽然之前的研究提示 PDI 参与其中，比如 PDI 基因 P4HB 的突变与严重的骨形成不全亚型科尔 - 卡彭特综合征（Cole-Carpenter syndrome）有关，并且在骨质疏松患者中，PDI 的下调与低骨强度相关。但是，PDI 在骨生物学中的具体作用一直没有通过基因修饰动物模型进行深入研究，其功能和潜在机制仍然是个谜。

为了解开这个谜团，来自苏州大学的研究人员开展了一项重要研究，相关成果发表在《Communications Biology》上。这项研究意义重大，它不仅揭示了 PDI 在骨发育中的关键作用，还为骨形成不全和骨质疏松等疾病的研究开辟了新的方向。

研究人员在这项研究中主要运用了以下几种关键技术方法：一是构建基因敲除小鼠模型，通过将 PDI^fl/fl小鼠与 Osx-Cre 小鼠杂交，获得成骨细胞特异性 PDI 基因敲除小鼠；二是进行组织学分析，利用 H&E 染色、TRAP 染色、油红 O 染色等方法，对小鼠骨骼组织进行观察和分析；三是运用蛋白质组学和分子生物学技术，如蛋白质定量质谱分析、Western blot、qPCR 等，检测相关蛋白和基因的表达水平 。

下面来看看具体的研究结果：

1. 删除成骨细胞中的 PDI 抑制骨骼生长：研究人员利用 Cre/loxP 重组系统，将 PDI^fl/fl小鼠与 Osx-Cre 小鼠杂交，构建成骨细胞特异性 PDI 基因敲除小鼠。结果发现，纯合成骨细胞 PDI 基因敲除小鼠（Osx-Cre/PDI^fl/fl）胚胎致死，杂合子敲除小鼠（Osx-Cre/PDI^fl/wt）则出现明显的生长迟缓、体型变小，骨骼长度和骨密度降低。这表明成骨细胞中的 PDI 对骨骼的生长发育起着关键作用。
2. Osx-Cre/PDI 小鼠的骨体积和骨形成率显著降低：对 8 周龄的雄性 Osx-Cre/PDI^fl/wt小鼠进行 micro-CT 扫描，发现其松质骨体积减少，小梁间距增加。通过对 3 周龄小鼠进行动态组织形态计量分析，发现 PDI 表达降低会抑制骨形成率。此外，Osx-Cre/PDI^fl/wt小鼠的血清碱性磷酸酶（ALP）、钙和磷水平也有所下降。这些结果进一步说明了 PDI 在骨形成过程中具有重要作用。
3. PDI 缺陷的成骨细胞促进脂肪细胞分化：由于成骨细胞和脂肪细胞有着共同的前体，研究人员通过 H&E 染色和油红 O 染色发现，Osx-Cre/PDI^fl/wt小鼠骨髓中的脂肪浸润增多，脂肪细胞数量显著增加。进一步研究发现，PDI 缺失会导致与脂肪细胞分化相关的基因 PPARγ、C/EBPα 等表达上调，表明 PDI 通过下调这些基因的表达来抑制脂肪细胞分化。
4. PDI 下调减少骨中胶原蛋白含量：研究人员通过苦味酸天狼星红（PSR）染色发现，与对照小鼠相比，Osx-Cre/PDI^fl/wt小鼠骨中薄胶原纤维（绿色）的比例显著增加，厚胶原纤维（红色）的比例显著减少，总胶原纤维束的数量也明显降低。这表明 PDI 在骨发育过程中对胶原蛋白的合成是必需的。
5. 纯合 PDI 缺陷破坏生长板结构，抑制软骨内和膜内骨化，并减少破骨细胞数量：对 E18.5 的 Osx-Cre/PDI^fl/fl胚胎进行研究发现，其四肢缩短、骨化减少，颅骨、胸骨和椎骨等也受到影响。TRAP 染色显示，Osx-Cre/PDI^fl/wt和 Osx-Cre/PDI^fl/fl小鼠的破骨细胞数量显著减少；Von Kossa 染色显示，这些小鼠的成骨细胞矿化减少，髓腔明显缩短。此外，H&E 染色表明，PDI 缺陷会导致生长板发育异常，软骨细胞增殖受损。
6. PDI 缺陷抑制成骨细胞功能和分化：从新生 PDI^fl/fl小鼠的颅骨中分离出原代成骨细胞前体，感染表达 Cre 的腺病毒后，进行成骨细胞诱导分化。结果发现，PDI 缺失导致成骨细胞数量减少，碱性磷酸酶活性和矿化结节形成显著降低，成骨细胞分化标记基因 Col1a、ALPL 等的表达也明显下降。这表明 PDI 对成骨细胞的功能和分化至关重要。
7. 成骨细胞中 PDI 的缺失导致细胞凋亡和内质网应激：研究发现，PDI 缺陷的成骨细胞中，凋亡标记物 caspase 3 的表达上调，内质网应激标记物的表达也显著增加。但 MTT 检测表明，PDI 缺失对成骨细胞的增殖没有影响。此外，PDI 缺陷会诱导 ERp5 和 ERp57 等 PDI 家族成员的表达上调，作为一种补偿机制。
8. PDI 缺陷降低成骨细胞中胶原蛋白脯氨酰 4 - 羟化酶（C-P4H）α 亚基的表达：通过定量质谱分析和 Western blot 验证，发现 PDI 缺陷的成骨细胞中，胶原蛋白脯氨酰 4 - 羟化酶（C-P4H）的 α 亚基 P4HA1、P4HA2 和 P4HA3 的表达显著下调。这可能与成骨细胞分化不良或数量减少有关。

综合上述研究结果，研究人员得出结论：PDI 对成骨细胞的分化、功能以及胶原蛋白的形成至关重要，它是成骨细胞中 C-P4Hα 亚基表达所必需的。PDI 在调节间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞的分化方向上也起着重要作用，同时还间接影响破骨细胞的发育。这项研究揭示了 PDI 功能异常可能是骨形成不全和骨质疏松的一种新的发病机制，PDI 有望成为这些疾病基因治疗的新靶点，为相关疾病的治疗提供了新的思路和潜在方向。