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研究人员探究柯萨奇病毒 B3（CVB3）VP3 蛋白 63 位突变影响，发现其改变病毒释放、传播等机制。
柯萨奇病毒 B3（Coxsackievirus B3，CVB3）隶属小 RNA 病毒科肠道病毒属，在病毒学研究领域可是个 “明星分子”。传统观念里，它一直被当作典型的裂解性病毒，但近年来的研究却让人大跌眼镜 —— 它居然还能 “偷偷摸摸” 地通过非裂解方式，藏在细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）里溜出细胞。这一发现瞬间点燃了科研人员的好奇心，大家都想弄清楚这背后的分子机制。而且，之前的研究还发现，CVB3 的 VP3 蛋白第 63 位氨基酸突变后，病毒的适应性和释放方式好像都发生了变化，可具体原因却一直是个谜。为了解开这些谜团，来自西班牙巴伦西亚大学 - 西班牙国家研究委员会（Universitat de València-CSIC）、乌拉圭共和国大学、蒙得维的亚巴斯德研究所等机构的研究人员展开了深入研究。相关成果发表在《Scientific Reports》上。
在本次研究中，研究人员主要运用了定点突变、病毒滴定、噬斑实验、分子动力学模拟等技术方法。首先，通过定点突变技术，在编码 mCherry 报告基因的 CVB3 Nancy 感染性克隆中引入 N63H、N63Y、N63F、N63W、N63D 和 N63L 突变。接着，利用病毒滴定实验测定病毒滴度，以此评估病毒的感染能力。然后，进行噬斑实验，测量不同突变体在琼脂和琼脂糖培养基中的噬斑大小，判断病毒的传播能力。最后，借助分子动力学模拟技术，研究 VP3 蛋白 N63 位点突变对病毒原体结构和动力学的影响 。
研究结果如下：
- N63 在肠道病毒属中的相关性：研究人员对 281 种肠道病毒的序列进行分析，发现 N63 在不同种属的肠道病毒中保守性存在差异。在肠道病毒 B 和 C 中，天冬酰胺（N）较为常见，但在其他种属中出现频率较低，在鼻病毒 B 中甚至完全不存在。
- N63 决定病毒在膜相关复合物中的释放：研究人员通过实验发现，与野生型（WT）病毒相比，芳香族突变（N63H、N63Y、N63F、N63W）和 N63D 突变显著降低了病毒作为膜相关复合物释放的比例。这表明 VP3 蛋白 63 位的特定突变会影响病毒子代的释放方式。
- N63 位的芳香族残基增加病毒在细胞培养中的传播：在细胞培养实验中，研究人员观察到，在感染初期，各突变体与野生型病毒的感染情况相似，但在感染 18 - 21 小时后，携带芳香族氨基酸的突变体病毒传播速度明显快于野生型、N63D 和 N63L 突变体。这说明 N63 位的芳香族残基能够促进病毒在细胞培养中的传播。
- N63 位的芳香族残基选择性增加含琼脂糖培养基中的噬斑大小：在琼脂糖培养基中，携带芳香族氨基酸的突变体（N63H、N63Y、N63F）和 N63D 突变体的噬斑明显大于野生型和 N63L 病毒。而且，部分突变体在琼脂糖培养基中的噬斑大小变化比在琼脂培养基中更为显著，这表明某些氨基酸在 N63 位可能改变了病毒颗粒与硫酸化聚糖的相互作用。
- CVB3 原体和 N63 位点突变体的分子动力学：分子动力学模拟结果显示，不同突变体的原体稳定性、紧凑性和溶剂可及性存在差异。例如，N63H 和 N63Y 表现出较高的均方根偏差（RMSD）值，结构更松散；N63F 则具有最高的紧凑性。同时，一些突变体（N63H、N63Y、N63F 和 N63D）在 VP4、VP2 和 VP1 区域表现出波动，可能导致这些区域的不稳定。
研究结论和讨论部分指出，VP3 蛋白 63 位的芳香族氨基酸会减少病毒在释放过程中与膜结构的结合，加速病毒在细胞培养中的传播，这一发现有助于解释近年来不同研究中在细胞培养和体内实验中 N63 突变体的出现。同时，研究还发现 N63 位点的某些氨基酸可能影响病毒与硫酸化聚糖的相互作用，而且分子动力学模拟结果与实验表型之间存在一定差异，这凸显了粗粒度模拟在捕捉精细分子相互作用方面的局限性。此外，该研究也存在一定的局限性，如未对膜相关病毒颗粒进行结构和分子特征的表征。不过，这些 N63 突变体为后续研究 CVB3 及其他肠道病毒与膜和 EVs 相关的病毒复制和释放机制提供了重要工具，未来研究还可进一步探究不同肠道病毒成员之间利用膜相关释放机制的重组事件。
