水解缺陷型镶嵌微管：忠实模拟 GTP 帽结构的新突破

为探究微管 GTP 帽结构特性，研究人员构建水解缺陷型突变体，发现 20% Q + N 镶嵌微管可模拟 GTP 帽，助力相关机制研究。

　　微管，作为细胞内的重要结构，就像细胞的 “脚手架”，支撑着细胞的各种活动。它由 αβ - 微管蛋白异二聚体组成，呈现出独特的管状结构，在细胞内物质运输、细胞分裂时染色体分离等过程中都发挥着关键作用。微管的一个关键特性是其动态不稳定性，即在生长和收缩状态之间随机切换，而这一特性的核心奥秘就藏在微管生长末端的 GTP 帽（GTP - tubulin rich region，富含 GTP - 微管蛋白的区域）中。

GTP 帽就像是微管生长末端的 “保护罩”，由于 GTP - 微管蛋白添加到微管末端后核苷酸水解延迟，使得该区域富含 GTP - 微管蛋白，从而稳定微管。一旦 GTP 帽丢失，不稳定的 GDP - 微管蛋白区域暴露，微管就会从生长状态转变为收缩状态，这一过程被称为灾变（catastrophe）。因此，深入了解 GTP 帽的结构特性，对于揭示微管动态不稳定性的基本机制至关重要。

然而，目前对于 GTP 帽的研究面临诸多挑战。虽然冷冻电镜（cryo - EM）已成功解析了 GDP - 微管的晶格结构，但由于微管生长末端的异质性，如原纤维长度和曲率的变化，以及 GTP - 微管蛋白区域大小的随机波动，使得高分辨率的 GTP 帽结构难以获得。此前，研究人员尝试使用非水解性 GTP 类似物聚合微管来模拟 GTP 帽，但不同类似物产生的微管在结构和生化性质上存在差异，难以确定哪种是理想的 GTP 帽模拟物。同时，水解缺陷型重组微管蛋白突变体的出现虽带来了新的研究方向，但这些突变体同样存在问题，它们在产生稳定微管晶格的同时，也会表现出不同的突变特异性效应，影响对 GTP 帽真实结构和性质的研究。

为了攻克这些难题，来自巴塞罗那科技学院基因组调控中心（Centre for Genomic Regulation, CRG）、保罗谢勒研究所（Paul Scherrer Institut）等机构的研究人员 Juan Estévez - Gallego、Thorsten B. Blum 等开展了一项深入研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员在实验中运用了多种关键技术方法。在蛋白表达与纯化方面，通过对昆虫细胞进行改造，使其表达特定的微管蛋白突变体，然后经过一系列复杂的纯化步骤，获得高纯度的微管蛋白。对于微管结构的分析，cryo - EM 技术发挥了重要作用，它能够在接近原子分辨率的水平上观察微管的结构。在观察微管动态特性时，结合了干涉反射显微镜（IRM）和全内反射荧光显微镜（TIRF）技术，实时追踪微管的生长和收缩过程。此外，质谱实验用于确定镶嵌微管中不同突变体的比例，浊度测定法用于研究微管的聚合动力学。

下面来看具体的研究结果：

1. 人 α^E254Q - 微管蛋白形成稳定的 GTP - 微管：研究人员构建了一种水解缺陷型人微管蛋白突变体 α^E254Q，通过替换 α - 微管蛋白第 254 位的催化谷氨酸残基为谷氨酰胺，实现了对野生型微管蛋白最小程度的修饰。实验表明，α^E254Q - 微管蛋白聚合形成的微管含有 GTP，且在整个晶格中稳定存在，这与野生型微管仅在生长末端含有 GTP 的情况不同。利用 IRM 和 TIRF 显微镜观察发现，α^E254Q - 微管在聚合过程中没有出现灾变现象，且 EB3 蛋白能够均匀地结合在其表面，进一步证明了其稳定性。
2. α^E254Q - 微管显示 GTP - 晶格和突变特异性属性：α^E254Q - 微管与 EB3 的结合特性与其他突变体有所不同，其解离常数为 8.3 ± 2.9 nM，与 α^E254A - 微管相近，但与 α^E254N - 微管差异明显。在成核和生长特性方面，α^E254Q - 微管相较于其他突变体更接近野生型，但在与 EB3 共聚合时，会出现不自然的弯曲现象，这表明即使是对微管蛋白关键催化残基的微小修饰，也会影响微管的晶格属性。
3. 混合突变微管蛋白消除突变特异性效应：为了减少突变特异性效应，研究人员将 α^E254Q 和 α^E254N 两种突变体按不同比例混合聚合形成镶嵌微管。通过 TIRF 显微镜观察发现，当 α^E254Q - 微管蛋白在混合物中的比例达到 5 - 10% 时，α^E254N - 微管特有的分段式 EB3 结合现象消失；当 α^E254Q - 微管蛋白比例超过 30% 时，微管会出现过度弯曲和不连续生长的现象。综合考虑，当 α^E254Q 和 α^E254N 以 20:80 的比例混合（20% Q + N - 微管）时，微管的生长速度与野生型相似，且突变特异性效应得到有效消除。
4. 镶嵌 20% Q + N - 微管是忠实的 GTP 帽模拟物：对 20% Q + N - 微管的多项生化特性进行量化分析后发现，其与 EB3 的结合亲和力较高，解离常数为 14.0 ± 2.6 nM，接近野生型 GTP 帽与 EB3 的结合亲和力。在生长速度方面，20% Q + N - 微管在不同微管蛋白浓度下的生长速度与野生型微管非常相似，而与 α^E254Q 和 α^E254N - 微管差异显著。此外，20% Q + N - 微管的自发成核效率也与野生型 GTP - 微管蛋白相近，且其微管的曲率更接近野生型，这些结果都表明 20% Q + N - 微管是一种忠实的 GTP 帽模拟物。
5. α^E254Q 和 20% Q + N - 微管的晶格参数：利用 cryo - EM 技术对 α^E254Q 和 20% Q + N - 微管的晶格结构进行分析，发现 α^E254Q - 微管的二聚体上升距离为 82.34 ± 0.00 ?，相较于野生型 GDP 微管有轻微的晶格扩张，且具有轻微的正原纤维扭转。20% Q + N - 微管的二聚体上升距离为 83.24 ± 0.01 ?，原纤维扭转角度为 + 0.10 ± 0.01°，与野生型 GDP 微管相似。当微管被 EB3 的钙调蛋白同源结构域（EB3 - CH）修饰后，α^E254Q 和 20% Q + N - 微管的晶格仍保持扩张状态，但出现了诱导的负扭转，这表明 α^E254Q 能够阻止 GTP 微管晶格的压缩。

在研究结论与讨论部分，研究人员指出，20% Q + N 镶嵌微管作为一种忠实的 GTP 帽模拟物，成功分离出了与稳定 GTP 微管相关的主要结构和生化晶格特征，为深入了解 GTP 帽的结构特性和 GTP 水解途径提供了重要依据。不同的非水解性 GTP 类似物和 α - 微管蛋白催化位点突变虽都能使微管稳定，但它们的结构和生化性质差异显著，这凸显了微管晶格对 GTP 水解位点微小变化的敏感性。镶嵌微管方法的成功应用表明，打破局部结构变化的重复性可以使微管结构 “正常化”。此外，研究还发现 GTP 帽具有扩张的晶格结构，而原纤维扭转的变化可能是微管晶格压缩和 GTP 水解过程中的一个过渡状态。

总的来说，这项研究为微管 GTP 帽结构和功能的研究开辟了新的道路，其成果不仅有助于进一步理解微管动态不稳定性的分子机制，还为后续研究微管相关疾病的发病机制和药物研发提供了重要的理论基础。未来，基于这些发现，有望开发出更具针对性的治疗策略，干预微管相关的生理和病理过程。