简化低污染风险高效小鼠成肌细胞分离与分化实验方案

为解决成肌细胞分离难题，研究人员优化分离及分化培养方案，发现 DMEM 更利于分化，意义重大。

　　在肌肉的世界里，有一种神奇的细胞 —— 成肌细胞（Myoblasts），它就像是肌肉生长和修复的 “小工匠”。成肌细胞起源于肌肉干细胞（MuSCs）的增殖，在维持骨骼肌的生理完整性方面发挥着关键作用。当肌肉受伤时，这些 “小工匠” 们就会迅速行动起来，通过增殖、分化、融合等一系列操作，修复受损的肌肉组织。

然而，想要深入了解这些 “小工匠” 并不容易。从鼠骨骼肌中分离纯化原代成肌细胞，对于科研新手来说，就像是一场艰难的挑战。以往的分离方法存在诸多问题，比如步骤繁琐、容易污染，而且分离出的细胞纯度和活性也不尽如人意。同时，在成肌细胞的分化培养方面，也缺乏一个明确的最优方案，不同的培养基对成肌细胞分化的影响差异很大，这使得相关研究进展缓慢。

为了攻克这些难题，中山大学附属第三医院的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Advanced Biotechnology》上，为成肌细胞的研究开辟了新的道路。

研究人员主要采用了机械消化、酶消化、过滤以及差异黏附等关键技术方法。首先通过机械消化初步处理肌肉组织，接着利用酶消化进一步分离细胞，然后经过过滤去除杂质，最后借助差异黏附技术提高成肌细胞的纯度。同时，研究人员还使用了流式细胞术对细胞进行分析。

研究结果如下：

1. 分离的原代成肌细胞形态变化：在分离后的最初 24 小时，视野中存在大量杂质，成肌细胞呈略纺锤形。培养 24 小时后，细胞变得更加细长。培养至 72 小时，污染细胞逐渐减少，成肌细胞形态更均匀。到 96 小时，污染细胞几乎消失，成肌细胞呈现典型的细长双极形状。
2. F10 和 DMEM 培养基对原代成肌细胞分化效果的比较：研究人员将等量的成肌细胞分别接种在 F10 和 DMEM 培养基中进行分化培养。显微镜观察发现，使用 DMEM 作为分化培养基时，分化后的细胞肌丝更粗。定量 PCR（qPCR）分析表明，在 DMEM 培养条件下，分化标记物肌球蛋白重链（MyHC）和肌细胞增强因子 2C（MEF2C）的 RNA 表达水平显著上调。蛋白质免疫印迹（WB）结果也证实，使用 DMEM 作为分化培养基时，成肌细胞分化标记物的蛋白质水平上调更明显。这表明 DMEM 培养基作为原代成肌细胞的分化培养基更有效，能支持更大程度的形态分化和关键生肌标记物的上调。
3. 实验中遇到的问题及解决方法：在实验过程中，研究人员也遇到了一些问题。比如细胞污染，他们通过在生物安全柜中进行肌肉组织分离、在培养基和 PBS 中添加 0.2% 两性霉素 B 以及更换手套防止交叉污染等措施解决。对于大组织碎片和过滤缓慢的问题，可更换细胞滤网、延长手动解离时间、延长酶消化时间以及充分吹打组织碎片来解决。若细胞异质性高，可增加差异黏附步骤；若成肌细胞产量低，可增加小鼠样本数量或彻底分离肌肉组织。

研究结论与讨论部分指出，成肌细胞在骨骼肌的生长、发育、损伤修复以及维持肌肉内环境稳定中起着不可或缺的作用。该研究建立的成肌细胞分离方案高效省时、污染风险低，且能获得大量有活力的细胞。同时，通过比较 F10 和 DMEM 培养基，明确了 DMEM 在成肌细胞分化方面更具优势，能形成更厚的肌管，促进分化标记物的高表达。这一研究成果为探索成肌细胞的分子和功能特性提供了可靠的方法，为相关研究奠定了坚实的基础，对深入了解肌肉相关疾病的发病机制和治疗策略具有重要的意义，有望在未来推动肌肉疾病治疗领域取得新的突破。