纠正广泛使用的逆转录病毒质粒中启动子和 β- 内酰胺酶开放阅读框方向，恢复细菌生长

《Scientific Reports》：Correcting promoter and beta-lactamase ORF orientation in a widely-used retroviral plasmid to restore bacterial growth

为解决 pBMN-I-GFP 质粒致大肠杆菌生长异常问题，研究人员纠正其基因方向，恢复抗性且不影响功能。

　　在分子生物学的奇妙世界里，基因传递就像一场精密的 “快递” 行动，逆转录病毒质粒则是重要的 “包裹” 载体。pBMN-I-GFP 质粒作为常用的逆转录病毒载体，被全球数千实验室用于生产逆转录病毒颗粒，帮助将基因精准 “投递” 到细胞中，在基因治疗、细胞生物学研究等领域发挥着关键作用。

然而，这个看似可靠的 “快递员” 却出现了问题。研究人员发现，用 pBMN-I-GFP 质粒转化的大肠杆菌在含有氨苄青霉素或羧苄青霉素的选择性 LB 琼脂平板上无法正常生长，这一现象与其他类似的逆转录病毒载体大相径庭。无论怎么调整培养条件，都无法解决这个问题，这给相关实验带来了极大的困扰。为了找出背后的原因，来自德国弗里德里希 - 亚历山大大学埃尔朗根 - 纽伦堡分校（Friedrich-Alexander-Universit?t Erlangen-Nürnberg）分子免疫学系的 Jürgen Wittmann 展开了深入研究。

研究人员通过一系列实验，发现 pBMN-I-GFP 质粒中 β- 内酰胺酶（bla）基因及其部分启动子发生了倒位。这一倒位就像把基因的 “开关” 装反了，使得 bla 基因无法正常表达，细菌也就失去了对抗生素的抗性，无法在含有抗生素的平板上生长。

为了解决这个问题，研究人员设计并构建了一个新的质粒 prBMN-I-EGFP，纠正了 bla 基因和 P3 启动子的方向。实验结果令人振奋，用 prBMN-I-EGFP 质粒转化的大肠杆菌在选择性平板上能够正常生长，β- 内酰胺酶活性也恢复正常，这表明纠正基因方向成功恢复了质粒的抗生素抗性。更重要的是，对 prBMN-I-EGFP 质粒进行逆转录病毒功能测试发现，它在小鼠细胞系中的转染和感染效率与原始的 pBMN-I-GFP 相当，这意味着在修复了生长问题的同时，并没有影响质粒在基因传递方面的 “本职工作”。

该研究成果发表在《Scientific Reports》上，为众多使用 pBMN-I-GFP 质粒的实验室提供了关键的解决方案，也强调了对常用质粒进行序列验证的重要性。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是牛津纳米孔技术（ONT）测序，通过它精确测定质粒的完整序列，从而发现 pBMN-I-GFP 质粒的基因倒位问题；其次是酶切分析，利用特定的限制性内切酶对质粒进行酶切，从酶切结果中发现异常，辅助确定基因倒位；此外，还进行了 β- 内酰胺酶活性检测，直观判断细菌产生 β- 内酰胺酶的情况，验证基因方向纠正后抗生素抗性的恢复。

下面来看具体的研究结果：

1. 大肠杆菌在选择性平板上生长失败：用 pBMN-I-GFP 质粒转化大肠杆菌 Stbl3 细胞后，在含有羧苄青霉素或氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上培养，过夜后没有菌落生长，而类似的 pBabe Puro 质粒转化的大肠杆菌则能正常生长。尝试多种优化生长条件的方法，如延长培养时间、改变培养温度、调整培养基成分等，都无法改善 pBMN-I-GFP 质粒转化的大肠杆菌的生长情况。
2. pBMN-I-GFP 的酶切和序列分析：对 pBMN-I-GFP 质粒进行酶切时，发现用 FspI 酶切的结果与预期不符。通过 ONT 测序分析，发现质粒实际长度为 6353bp，比报道的长，且只有一个 FspI 位点。进一步分析发现，AmpR 开放阅读框（ORF）及相邻序列的方向发生了倒位，这很可能是在构建 pBMN-I-GFP 质粒时，使用 BspHI 限制位点导致的，该倒位可能破坏了 bla 基因的表达，进而影响了质粒的抗生素抗性。
3. 通过逆转 AmpR 基因片段方向挽救抗生素抗性：构建新质粒 prBMN-I-EGFP，纠正 bla 基因和 P3 启动子的方向。转化大肠杆菌 Stbl3 细胞后，在含有羧苄青霉素的 LB 琼脂平板上能形成大量菌落，而 pBMN-I-GFP 仍然不能赋予细菌抗生素抗性。对其他 pBMN-I-GFP 的衍生质粒进行类似操作，也得到了相同的结果。通过 β- 内酰胺酶活性检测，发现 prBMN-I-EGFP 和其他纠正后的质粒能使细菌产生 β- 内酰胺酶，从而恢复抗生素抗性。
4. 纠正 AmpR 片段方向对逆转录病毒功能的影响：用 pBMN-I-GFP 和 prBMN-I-EGFP 转染 Platinum-E 包装细胞，产生逆转录病毒上清液，感染小鼠原 B 细胞系 38B9 和 NIH3T3 细胞。通过流式细胞术分析发现，两种质粒的转染效率和感染效率相当，这表明纠正 bla ORF 和 P3 启动子的方向没有对质粒的逆转录病毒特性产生不利影响。

研究结论和讨论部分再次强调，pBMN-I-GFP 质粒中 bla ORF 和部分启动子的倒位是导致大肠杆菌生长缺陷和抗生素抗性丧失的原因，纠正这一倒位能够恢复细菌生长和 bla 活性。同时，纠正后的质粒在逆转录病毒功能方面与原始质粒相当，这为后续研究提供了可靠的工具。此外，该研究还指出，对常用质粒进行彻底的序列验证至关重要，因为即使是微小的序列错误也可能对实验结果产生重大影响。未来研究可以进一步探讨某些携带 pBMN-I-GFP 及其衍生物的大肠杆菌细胞在延长培养时间后能够生长的原因，以及尝试更多不同的大肠杆菌菌株，优化实验条件，为相关研究提供更多的参考。