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为探究 Pol A 家族 DNA 聚合酶内在链置换活性机制，研究人员以酵母线粒体 Mip1 为模型展开研究。通过冷冻电镜等技术，解析了 Mip1 - DNA 复合物结构，揭示关键结构元件，发现其变体影响线粒体功能，为理解该类酶复制机制提供依据。
在生命的微观世界里，DNA 复制如同一场精密的 “分子舞蹈”，对生物的生存和繁衍至关重要。其中，DNA 聚合酶（DNAP）在复制过程中发挥着核心作用，尤其是具有内在链置换活性的 DNAP，它能够在复制时拷贝亲本链 DNA，同时置换非编码链，这一过程在许多先进的 DNA 扩增技术中至关重要，比如滚环扩增和等温 DNA 扩增，这些技术在现场诊断、即时护理等领域应用广泛，具有快速、简单、成本低的优势。
然而，尽管这类酶应用如此广泛，其内在链置换活性的分子基础却一直是个谜。此前，还没有获得含有下游 DNA 双链的链置换 DNAP 的高分辨率结构，这就像拼图缺少了关键的几块，使得科学家们难以完整地理解这一重要过程。因此，开展相关研究以揭示其机制迫在眉睫，这不仅有助于深入了解生命的遗传信息传递过程，还可能为遗传疾病的治疗策略开发以及新型 DNA 扩增和诊断工具的设计提供关键线索。
为了解开这个谜团，来自托马斯杰斐逊大学（Thomas Jefferson University）和塔尔图大学（University of Tartu）的研究人员，以酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）线粒体中的单亚基 Pol A 家族 DNAP——Mip1 为研究对象，展开了深入研究。最终，他们的研究成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在蛋白处理方面，对 Mip1 进行表达和纯化，并通过定点突变获得其变体。在结构解析上，利用冷冻电镜（cryo - EM）技术，结合单颗粒分析和 3D 变异性分析，得到了 Mip1 - DNA 复合物的高分辨率结构。此外，通过引物延伸实验、电泳迁移率变动分析（EMSA）等生化实验，以及构建酵母突变体进行体内实验，探究 Mip1 的功能。
下面来看具体的研究结果：
- Mip1 - DNA 复合物的整体结构：研究人员让 Mip1 在引物 - 模板构建体上组装复合物，并结合冷冻电镜及相关分析技术，得到了 4 种分辨率在 2.4 - 3.0 ? 的高分辨率结构。Mip1 呈现出 Pol A 家族 DNAP 特有的右手形状，其与 DNA 形成多个氢键，稳定引物 - 模板双链和下游 DNA。与人类线粒体 DNAP Polγ 相比，Mip1 具有独特的结构元件，如 Joist 和 Catcher loop123。
- 下游 DNA 双链的初始解链：结构 I 和 II 展示了初始链置换过程。在结构 I 中，下游 DNA 双链完全碱基配对，SD loop 中的 F849 与下游 DNA 碱基对堆积，N847 阻断非模板链进入活性位点，Wedge helix 的 R265 插入下游双链之间。结构 II 中，R265 摆动，导致下游 DNA 解链 1 bp。研究人员通过构建 Mip1 变体进行引物延伸实验，证实了这些结构元件在链置换中的重要作用456。
- Catcher loop 辅助的 DNA 弯曲介导链置换：在结构 III 和 IV 中，Catcher loop 与下游 DNA 相互作用并使其弯曲。在结构 IV 中，这种弯曲导致模板 DNA 链额外的扭结，使下游 DNA 解链增加到 3 bp。通过构建 Catcher loop 突变体进行实验，发现其与下游 DNA 的相互作用对链置换活性至关重要，且影响 Mip1 的持续性789。
- Mip1 变体对线粒体 DNA 维持和呼吸的影响：研究人员构建酵母 Mip1 变体，通过质粒洗牌实验和分析线粒体 DNA，发现 Mip1 变体的体内活性与其链置换效率密切相关。例如，F849A 和 TETRA 变体导致细胞线粒体功能严重缺陷，失去线粒体 DNA，而其他一些变体也表现出不同程度的呼吸缺陷101112。
研究结论和讨论部分具有重要意义。研究揭示了 Pol A 家族 DNA 聚合酶 Mip1 内在链置换活性的机制，发现了 SD loop、Wedge helix 和 Catcher loop 等关键结构元件在链置换过程中的作用。Mip1 的链置换机制与 RNA 聚合酶既有相似之处，又有独特性，如利用特定结构元件插入 DNA 双链促进解链，以及 Catcher loop 介导额外碱基解链以提高合成速率和持续性。此外，酵母线粒体 DNAP 的 C 末端结构域可能对其活性有调节作用。这些发现为深入理解线粒体 DNA 复制机制提供了分子基础，也为开发针对致病性酵母物种的治疗策略提供了潜在靶点，同时为研究线粒体疾病及相关治疗提供了重要参考，推动了生命科学和健康医学领域在该方向的进一步探索。
