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本文通过 RT&Tag 和 SLAM-RT&Tag 技术，揭示 Polycomb 结构域和核斑点中 RNA 的独特特征与加工机制。
一、引言
细胞核中存在众多无膜区室，这些区室富含功能相关分子，RNA 是许多核区室的重要组成部分，在其中发挥着触发区室形成和参与加工过程等关键作用。因此，确定定位于核区室的 RNA 并评估其动态变化，对于理解这些区室中的生物学机制至关重要。
Polycomb 结构域是转录沉默且被 H3K27me3标记的染色质区域，在 3D 核空间中相互接触并形成离散焦点。然而，RNA 是否参与哺乳动物 Polycomb 结构域的调控，以及 RNA 是否存在于 Polycomb 结构域中并与之稳定结合，仍有待确定。
核斑点是含有大量 RNA 加工因子（特别是剪接因子）和 RNA（如 lncRNA MALAT1 和多聚腺苷酸化 mRNA）的核体，具有多种功能。虽然已有研究表明一些转录本会迁移到核斑点进行剪接或获得核输出能力，但内源性 RNA 迁移到核斑点的机制以及转录本在核斑点内的动态变化仍需进一步阐明。
为了深入研究这些问题，研究人员应用了逆转录和标记（RT&Tag）方法来分析 Polycomb 结构域和核斑点的转录组，并开发了 SLAM-RT&Tag 技术，将 RNA 代谢标记与 RT&Tag 相结合，以追踪核区室内转录本的动态变化。
二、研究方法
- RT&Tag 技术：RT&Tag 是一种原位抗体介导的酶连接方法，利用抗体将 oligo (dT) 引物和 Tn5 酶连接到感兴趣的表位上。靠近表位的 RNA 随后被逆转录，RNA - cDNA 杂交体被 Tn5 酶标记，最后通过 PCR 生成 Illumina 测序文库。该技术使用具有完整 Polycomb 结构域和核斑点的天然细胞核，非常适合研究核区室。
- SLAM-RT&Tag 技术：研究人员将硫醇（SH）连接的 RNA 代谢测序（SLAM-seq）协议的步骤整合到 RT&Tag 中，开发出 SLAM-RT&Tag 技术。该技术首先用 4 - 硫尿苷（s4U）处理细胞对 RNA 进行代谢标记，然后进行细胞核分离、与磁珠结合、碘乙酰胺（IAA）处理，再进行标准的 RT&Tag 步骤。在逆转录过程中，羧酰胺甲基化的 s4U 会被逆转录酶误读，导致 T>C 转换。通过对测序数据的分析，可以量化转录本的代谢标记情况，从而研究转录本在核区室内的动态变化。
三、研究结果
- RT&Tag 检测核区室内的 RNA：研究人员使用 RT&Tag 技术从人女性 HEK293T 细胞中生成了针对 Polycomb 结构域（用抗 H3K27me3抗体）和核斑点（用 SC35 抗体）的测序文库，并以非特异性免疫球蛋白 G（IgG）抗体生成的文库作为核质对照。主成分分析（PCA）显示，不同靶向的 RT&Tag 文库聚类明显不同，表明 Polycomb 结构域和核斑点的 RNA 含量存在差异。通过 DESeq2 分析，确定了在每个区室中相对于 IgG 富集的转录本。此外，RT&Tag 成功检测到了已知定位于每个核区室的转录本的富集，如 XIST lncRNA 在 H3K27me3靶向的 RT&Tag 文库中高度富集，MALAT1 lncRNA 在 SC35 靶向的 RT&Tag 文库中高度富集，这证明了 RT&Tag 能够成功原位检测核区室内富集的转录本。
- 长基因在 Polycomb 结构域附近转录：在果蝇中的研究发现 Polycomb 结构域存在低水平的新生转录，但在人类 K562 细胞中，H3K27me3靶向的 RT&Tag 未检测到 Hox 基因转录本。通过与已发表的 H3K27me3靶向的切割和标记（CUT&Tag）数据比较，发现 H3K27me3靶向的 RT&Tag 检测到的转录本来自靠近 Polycomb 结构域的基因，这些基因通常很长，具有长内含子和平均长度的外显子。例如，IMMP2L 基因的转录本被 H3K27me3靶向的 RT&Tag 检测到，RT&Tag 信号在该基因的整个区域（包括内含子）都有富集。此外，这些转录本在靠近染色质时可能尚未进行剪接，且可能是新生转录本。敲除 Polycomb 抑制复合物 2 的核心成分 SUZ12 后，K562 细胞中出现了大量差异剪接事件，其中外显子跳跃事件在 Polycomb 标记相邻转录本中更为频繁，表明 Polycomb 结构域对这些转录本的正确剪接可能很重要。
- Polycomb 标记相邻转录本在 Polycomb 结构域附近是短暂的：应用 SLAM-RT&Tag 技术检测 Polycomb 标记相邻转录本的半衰期，发现其全局半衰期中位数为 3.2 小时，而在 Polycomb 结构域附近的局部半衰期平均为 1.6 小时。通过差异动力学分析，将转录本分为 “短暂” 和 “持久” 两类，发现超过一半产生 Polycomb 标记相邻转录本的基因被归类为短暂型，如 IMMP2L 基因。只有少数转录本（如 XIST、MALAT1 和 FANCL）被归类为持久型。这表明大多数 Polycomb 标记相邻转录本是新生转录本，在加工后离开染色质，尽管它们在染色质上停留的时间比平均前体 mRNA 长，可能是由于其长基因体转录所需时间较长。
- 核斑点包含部分剪接的多聚腺苷酸化转录本：研究人员将 SC35 靶向的 RT&Tag 富集的转录本定义为斑点转录本。这些转录本的表达水平低于全细胞 RNA-seq 评估的前 5% 表达基因，且与核斑点的距离和基因表达之间仅存在微弱的负相关。斑点转录本具有比平均 mRNA 更多的外显子和异构体变体，这意味着它们具有更复杂的剪接需求。SC35 靶向的 RT&Tag 信号在斑点转录本的转录末端位点（TES）上游和部分内含子中富集，RNA-FISH 实验也证实了核斑点中存在多聚腺苷酸化且未完全剪接的转录本。此外，斑点转录本与保留内含子（RI）相关，但缺乏核质或全细胞 RNA-seq 中的内含子信号，表明核斑点是转录后剪接的位点。
- 未完全剪接的转录本迁移到核斑点：核斑点缺乏染色质，因此斑点转录本并非在核斑点内直接转录。研究发现，产生斑点转录本的基因与核斑点的距离存在差异，只有 55% 的相关基因与核斑点相邻，其余转录本需要迁移到核斑点。无论转录起始位点如何，约 30% 的斑点转录本内含子和几乎所有 TES 都富集 SC35 靶向的 RT&Tag 信号，表明部分剪接的多聚腺苷酸化转录本从不同的转录起始位点迁移到核斑点。用剪接抑制剂普拉地诺利德 B（PladB）处理 K562 细胞后，诱导了许多 RI 事件，这些内含子在核斑点中的 SC35 靶向的 RT&Tag 信号增加，证明了未完全剪接的转录本在剪接抑制时会迁移到核斑点。
- 斑点转录本主要在核斑点中短暂扣留：分析 ENCODE RNA-seq 数据发现，几乎所有斑点转录本在细胞质中的含量都较低，表明它们被扣留核斑点中。通过 SLAM-RT&Tag 和差异动力学分析，发现只有少数斑点转录本（由 15 个基因编码）在核斑点中是持久的，如 lncRNA MALAT1，而 69% 的斑点转录本在核斑点中是短暂的。斑点转录本在核斑点中的局部半衰期较长，可能是由于转录本迁移时间、包含 detained introns（DIs）、剪接因子活性以及转录 - 输出（TREX）复合物的作用等因素。剪接抑制会增加斑点转录本在核斑点中的停留时间，说明其释放依赖于剪接。
- SRSF11 转录本在 PladB 处理后迅速从核斑点释放：剪接因子浓度通过可变剪接进行自调节，一些 CLK 和 SRSF 转录本定位于 K562 和 HEK293T 细胞的核斑点中。在 K562 细胞中，SRSF11 转录本在核斑点中存在，且其内含子在 RNA-FISH 实验中可在核斑点中观察到。用 PladB 处理 K562 细胞后，SRSF11 转录本的两个毒外显子被剪接掉，内含子快速剪接，转录本在核斑点中的水平逐渐下降，表明其从核斑点释放。此外，PladB 处理后 SRSF11 转录本在核斑点中的短暂性增加，说明其释放速度加快，这一过程可能对细胞响应剪接抑制时快速增加 SRSF11 蛋白水平具有重要意义，且与癌症和脑衰老等生理过程相关。
四、讨论
关于核斑点的功能存在多种假说，早期研究认为其可能是储存位点，后来的研究则表明转录本会通过核斑点进行剪接或获得核出口能力。本研究发现核斑点中的转录本存在 RI，且这些是未完全剪接的成熟转录本。未完全剪接的转录本在剪接抑制时迁移到核斑点，大多数转录本在核斑点中是短暂的，其释放依赖于剪接。因此，研究人员提出核斑点作为质量控制检查点，暂时储存未完全剪接的转录本，直到转录后剪接完成，然后这些转录本可以输出到细胞质中，这一机制确保只有完全剪接的 RNA 分子才能进入细胞质。
转录本在核斑点中的半衰期较长，可能是由于转录本迁移时间、包含 DIs、剪接因子活性以及 TREX 复合物的作用等因素。在 Polycomb 结构域方面，研究未检测到其内部的转录，而是发现了来自相邻超长基因的转录，这些基因可能进化到靠近 Polycomb 结构域以避免在长内含子完全转录前发生过早的内部剪接。而未完全剪接的成熟转录本则迁移到核斑点进行转录后剪接，这表明核区室通过使转录本接触特定浓度的剪接因子来促进 RNA 加工。
五、研究局限性
RT&Tag 是一种基于原位的方法，其将转录本分配到核区室的准确性受到免疫试剂与细胞核内转录本接近程度的限制。未来需要更精确的标记半径的检测方法来进一步完善对亚核位置的研究。
六、资源可用性
