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为探究非经典脯氨酸替代物对蛋白折叠影响，研究人员以 ΔaPro 开展研究，发现其可稳定 aPP 折叠，为蛋白模拟物设计提供新策略。
在蛋白质的奇妙世界里，脯氨酸（Pro）就像一个独特的 “小工匠”，对蛋白质的折叠和识别起着至关重要的作用。它有着特殊的结构，其 backbone ? 二面角被限制在约?65°，脯氨酰叔酰胺更倾向于采用顺式几何构象，而且它的吡咯烷环还能呈现出两种不同的褶皱构象。这些特性使得脯氨酸在调节蛋白质结构和功能方面扮演着核心角色，也吸引着科学家们尝试用其他分子来替代它，从而创造出新型的蛋白质模拟物（proteomimetics）。
目前，虽然科学家们已经知道脯氨酸的重要性，但对于非经典脯氨酸类似物如何影响蛋白质的结构、动力学和功能，仍有许多未解之谜。而且在设计新型蛋白质模拟物时，如何准确地选择合适的脯氨酸替代物，也是一个亟待解决的问题。为了揭开这些谜团，来自美国圣母大学（University of Notre Dame）、英国牛津大学（University of Oxford）和美国匹兹堡大学（University of Pittsburgh）的研究人员携手展开了一项深入的研究。他们将研究成果发表在了《Communications Chemistry》上。
研究人员用到的关键技术方法主要有以下几种：一是通过固相合成法（SPPS）制备含有 ΔaPro 的肽段，优化合成步骤提高效率；二是利用圆二色谱（CD）技术分析肽段的二级结构和热稳定性；三是借助多维核磁共振光谱（NMR）确定蛋白的高分辨率溶液结构；四是运用分子动力学（MD）模拟研究蛋白结构的动态变化。
下面来看看具体的研究结果：
- 含有 ΔaPro 的肽段合成：研究人员开发了一种更有效的合成方法，通过对 Fmoc-Asp-OBn 进行侧链操作，生成醛后保护为二甲基缩醛，再经过一系列反应得到 N - 氨基化的 Adb 衍生物，与 Fmoc 保护的氨基酸氯化物反应，经氢解、固相合成、裂解环化等步骤，成功将 ΔaPro 引入肽段1。
- ΔaPro 的 PPII 倾向性：研究人员使用八肽模型系统测量 ΔaPro 的 PPII 倾向性。合成含有 ΔaPro 的八肽 5 并与亲本八肽 6 对比，发现 5 的 CD 光谱出现异常，表明其采用了特定结构且随温度变化在两种构象间转变，这暗示 ΔaPro 可能影响肽段的 PPII 构象2。
- PPII 取代的 aPP 类似物的热稳定性：以禽胰多肽（aPP）为模型，研究人员对 aPP 的 PPII 螺旋区域 2 - 8 位残基进行扫描，合成多个含 ΔaPro 的类似物。CD 分析显示，部分位点替换导致 aPP 构象改变，而 Pro2、Gln4、Thr6 位点替换后能维持天然样三级结构。热稳定性研究发现，ΔaPro 在不同位点对 aPP 热稳定性影响不同，在 Gln4 位点可显著提高热稳定性，且优于 Pro345。
- PPII 取代的 aPP 类似物的 NMR 溶液结构：利用多维 NMR 光谱技术，研究人员测定了亲本肽（7）、ΔaPro4 aPP（10）、ΔaPro6 aPP（12）和 ΔaPro4/6 aPP 双突变体（15）的高分辨率结构。结果表明，ΔaPro 取代的类似物与亲本肽具有相似的三级折叠，但 10 在 N 端构象异质性降低，15 在环区域表现出最大的无序性。同时，15 的 Tyr7 和 Tyr7’侧链取向改变，影响了二聚体稳定性，不过其单体折叠稳定性增强，使整体热稳定性与 10 相当67。
- 环取代的 aPP 类似物的合成和热稳定性：aPP 在连接 PPII 和 α - 螺旋的环中含有保守的 Pro13，研究人员用 ΔaPro 取代 Pro13 合成类似物。CD 光谱和热变性研究表明，ΔaPro13 取代可显著稳定 aPP，而 Ala13 取代则导致不稳定。含有 ΔaPro4、6、13 的三取代肽 21 热稳定性进一步提高，但可能因破坏了四级结构而未表现出协同效应89。
- 分子动力学模拟：因 Pro13 取代的 aPP 类似物 NMR 结构计算不收敛，研究人员采用 MD 模拟。模拟结果显示，ΔaPro 在 4 和 6 位时，PPII 构象比例显著增加；在 13 位时，PPII 倾向性与天然 Pro 相似或略低。此外，三取代肽 21 失去了一些重要的分子间氢键，影响了二聚体稳定性，但整体仍保持二聚体状态1011。
在研究结论和讨论部分，研究人员发现非平面的脯氨酸替代物 ΔaPro 能显著影响 aPP 的三级和四级结构。它在多个位点可替代天然残基，且在某些位点能增强 aPP 的热稳定性，尤其是在连接 PPII 和 α - 螺旋的环区域。高分辨率 NMR 结构和 MD 模拟表明，ΔaPro 易采用 PPII 构象，维持 aPP 的天然折叠，这说明在 aPP 系统中，环褶皱对热稳定性的影响可能不如反式酰胺倾向和 ? 扭转限制重要。不过，ΔaPro 取代也可能破坏野生型结构中的非共价相互作用，影响蛋白稳定性。该研究不仅为脯氨酸替代物在蛋白质模拟物设计中的应用提供了新的思路，还为进一步理解蛋白质折叠和稳定性的机制奠定了基础。未来，研究人员将继续探索 ΔaPro 及相关单体在更多生物学相关领域的应用。
