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研究人员针对生物分子凝聚物构建难题，研究大肠杆菌 LplA 蛋白，发现其特殊相行为及应用潜力，意义重大。
细胞微观世界的奇妙探索：LplA 蛋白的独特之旅
在细胞这个微观的奇妙世界里，生物分子的组装与分离如同一场精密的舞蹈，时刻影响着细胞的各种活动。蛋白质自组装和相分离作为生物分子凝聚物（biomolecular condensates）和无膜细胞器（membraneless organelles，MLOs）形成的基础机制，参与了基因转录调控、染色质组装、细胞应激反应、代谢调节以及细胞分裂等众多关键过程。从合成生物学的角度看，构建具有特定功能的人工细胞区室，就像在细胞内搭建一个个高效运转的 “小工厂”，极具吸引力。然而，要实现这一目标困难重重。
目前，构建人工 MLOs 最常用的 “建筑材料” 是内在无序蛋白（intrinsically disordered proteins，IDPs）。虽然 IDPs 在构建人工凝聚物方面有操作简便、相行为可调等优点，但它们与内源性 MLOs 存在串扰，正交性差，而且很难用小分子进行特异性调控，就像一把不太精准的 “钥匙”，难以精确开启细胞内特定功能的 “锁”。因此，寻找一种能够满足构建需求、具有可调节相分离特性的蛋白质，成为了科研人员亟待解决的问题。
西湖大学的研究人员勇挑重担，针对这一难题展开了深入研究。他们把目光聚焦在了大肠杆菌的硫辛酸 - 蛋白连接酶 A（lipoate - protein ligase A，LplA）上。这项研究成果发表在《Nature Communications》上，为蛋白质相行为的研究和合成生物学的发展带来了新的曙光。
研究人员在探索 LplA 蛋白的过程中，运用了多种先进的技术方法。小角 X 射线散射（Small - Angle X - ray Scattering，SAXS）技术让他们能够在分子尺度上观察 LplA 蛋白相分离过程中的结构变化；荧光漂白恢复技术（FRAP）帮助他们研究蛋白凝聚物的动态特性；定点突变技术则使他们可以深入探究 LplA 蛋白组装和相分离的分子机制。通过这些技术的协同运用，研究人员一步步揭开了 LplA 蛋白的神秘面纱。
大肠杆菌 LplA 在体外经历可逆的 LCST 相分离
研究人员在纯化 LplA 蛋白并研究其对 GcvH 蛋白的脂酰化功能时，意外发现 LplA 蛋白在体外能发生可逆的溶胶 - 凝胶相转变。当把 LplA 蛋白在 4°C 下配制成 500 μM 的溶液时，它清澈透明，溶解性和分散性良好。但随着温度升高，溶液逐渐变浑浊，到室温时竟变成了一种自支撑的水凝胶。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，此时形成了微米级的聚集体和多孔交联网络，典型的水凝胶微观结构呈现在眼前。FRAP 测试进一步表明，纯化的 LplA - mEGFP 聚集体是低动态凝胶。而且，LplA 蛋白在快速的溶胶 - 凝胶循环中表现出良好的可逆性，反复循环后其催化活性也不受影响。
值得注意的是，LplA 蛋白表现出的较低临界溶液温度（lower critical solution temperature，LCST）相行为在蛋白质中非常罕见，尤其是在折叠蛋白中。大多数蛋白质具有较高临界溶液温度（upper critical solution temperature，UCST）行为。流变学实验表明，在特定的蛋白浓度和缓冲条件下，LplA 蛋白溶胶 - 凝胶转变的临界温度约为 13°C。通过测定 LplA 蛋白的相图，研究人员发现其相行为受离子强度、蛋白浓度和 pH 值等因素影响。SAXS 分析还揭示了 LplA 蛋白在相分离过程中，从单体到低阶聚集体再到高阶聚集体的结构变化。
LplA 在大肠杆菌中形成浓度依赖性凝聚物
既然 LplA 蛋白在体外有如此独特的相分离能力，那么在活细胞中又会怎样呢？研究人员首先标记了大肠杆菌 MG1655 基因组上的 lplA 基因，结果发现内源性 LplA 在细胞质中均匀分布，且荧光信号微弱，即使在各种细胞应激条件下也未观察到相分离现象。这是因为内源性 LplA 在大肠杆菌中的丰度很低，其转录水平也不会随培养条件和细胞应激发生显著变化。
随后，研究人员对过表达的 LplA 进行研究，发现无论是 LplA - mEGFP 还是 mEGFP - LplA 都能在大肠杆菌中形成聚集点，且多分布在细胞极区。用 1,6 - 己二醇处理后，这些聚集点会显著溶解，说明 LplA 在细胞中形成的是凝聚物而非不溶性包涵体。FRAP 检测发现，LplA - mEGFP 聚集点的荧光恢复率极低，这可能是由于在小体积细胞中 FRAP 技术存在局限性，也可能与蛋白和细胞环境的相互作用有关。此外，研究人员还发现，在细胞内 LplA 凝聚物的相行为对温度不敏感，而体外实验中添加拥挤剂模拟细胞环境后，LplA 的相转变温度降低，这表明大分子拥挤效应可能是导致 LplA 在体内失去温度敏感性的关键因素之一。
LplA 组装和相分离的分子基础
是什么力量驱动 LplA 蛋白的组装和相分离呢？研究人员通过定点突变技术，对 LplA 蛋白表面潜在的同型相互作用热点进行了深入研究。根据 LplA 蛋白的晶体结构，它是一个折叠良好的球状蛋白，在晶体的不对称单元中似乎形成三聚体。研究人员发现，LplA 蛋白的自组装实际上与浓度和环境有关，SAXS 数据也为其有序寡聚化提供了证据。
LplA 蛋白晶体结构中的 MolA 与 MolB、MolC 以两种不同方式接触并形成对称二聚体（MolA - MolB 和 MolA - MolC）。对这两个界面进行定点突变研究发现，MolA - MolC 界面上的盐桥网络对 LplA 蛋白的相分离起着至关重要的作用，破坏这些盐桥会完全消除 LplA 的相分离能力；而 MolA - MolB 界面上的疏水相互作用和部分带电残基也参与了相分离过程。通过一系列突变实验，研究人员确定了 LplA 蛋白多价同型相互作用的热点区域和关键残基，揭示了其高阶组装是通过两种不同的二聚化方式实现的，一种由静电相互作用主导，具有明确的方向性，另一种则涉及疏水和静电相互作用，结构特异性相对较弱。
LplA 相分离受硫辛酸特异性调控
对于细胞工程和合成生物学来说，能被特定小分子调控的人工凝聚物极具吸引力。LplA 蛋白在大肠杆菌中负责利用外源硫辛酸对靶蛋白进行 ATP 依赖的脂酰化修饰，其晶体结构显示有两个底物结合口袋，分别结合 ATP 和硫辛酸。研究人员发现，无论是 (R)- 硫辛酸还是 (R/S)- 硫辛酸，都能在几分钟内抑制纯化的 LplA 蛋白的相分离，而 ATP 则没有这种作用。硫辛酸的类似物 (R/S)- 硫代乙酰胺也有类似的抑制效果，而辛酸、辛酰胺和 1,3 - 丙二硫醇则无效。
通过等温滴定量热法（ITC）测定结合常数发现，(R)- 硫辛酸和 (R/S)- 硫代乙酰胺与 LplA 蛋白有显著结合，而辛酸则没有明显结合。在大肠杆菌中，1 mM 的硫辛酸和硫代乙酰胺都能溶解 LplA 凝聚物，进一步验证了体外实验的结果。研究人员还通过突变 LplA 蛋白硫辛酸结合口袋的 “守门” 残基，发现突变后的蛋白虽然仍能形成聚集点，但失去了对硫辛酸的响应能力，这表明硫辛酸是通过与 LplA 蛋白的底物口袋结合来抑制相分离，而不是直接干扰界面相互作用。
LplA 在哺乳动物细胞中形成正交凝聚物
LplA 凝聚物的化学可调性让研究人员想要进一步探索它在哺乳动物细胞中的应用。在 U2OS 细胞系中，mEGFP - LplA 能够形成凝聚物，用 1,6 - 己二醇处理后凝聚物会显著溶解，说明其可能是动态凝胶。FRAP 实验显示，mEGFP - LplA 凝聚物的恢复率接近 50%，这表明 LplA 凝聚物在 U2OS 细胞中的动态性明显高于体外和大肠杆菌细胞，可能是因为它与其他宿主蛋白共同组装，调节了其材料特性。
通过免疫荧光成像，研究人员发现 LplA 凝聚物与内质网、溶酶体、线粒体、自噬体等膜性细胞器以及应激颗粒、P - 小体等无膜结构都没有共定位现象，这表明 LplA 凝聚物在细胞质中具有正交性。同时，LplA 凝聚物也不会被细胞识别为病理性蛋白聚集体。用硫辛酸处理 U2OS 细胞后，LplA 凝聚物的体积会显著减小，而且其对硫辛酸和硫代乙酰胺的响应速度比体外和大肠杆菌细胞中慢，这可能与凝聚物的大小、扩散速率以及组成成分等多种因素有关。
研究结论与展望
大肠杆菌的 LplA 蛋白作为一种折叠良好的球状酶蛋白，在体外表现出罕见的 LCST 相行为，在体内无论是细菌细胞还是哺乳动物细胞中都能形成化学可调控的正交凝聚物。这一发现拓展了人们对蛋白质相行为的理解，为设计具有特定功能的凝聚物提供了新的思路。
LplA 蛋白的这种特性使其在多个领域具有潜在的应用价值。在生物医学方面，由于其催化活性和对小分子的响应性，它有望成为组织再生材料和生物传感器；在合成生物学领域，它可以作为构建人工无膜细胞器的正交 “建筑材料”，为实现更精准的细胞工程和基因调控提供可能。此外，这项研究也提醒科研人员，在过去的实验中，可能忽略了许多蛋白质的 “意外” 相行为，未来应更加关注蛋白质的这些特性，挖掘更多具有相分离能力的折叠蛋白，推动蛋白质相分离和生物分子凝聚物领域的进一步发展。
