Cell：新技术为CRISPR筛选安装了空间“透视镜”

　　

CRISPR-Cas9 技术的出现，为科学家们提供了强大的基因编辑工具，通过功能缺失混合筛选，人们能大规模探究基因功能，研究细胞生长、药物抗性和病毒感染等表型的遗传基础。将其与单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）结合后，可在同一细胞中实现目标基因抑制与转录组表达测定，为绘制细胞内基因回路带来曙光。然而，这些方法丢失了细胞的局部背景信息，无法解析细胞间相互作用，毕竟细胞的基因表达会受其周围邻居的影响。

与此同时，光学混合筛选技术兴起，将原位 gRNA 测序与成像分析相结合。这种方法虽然通量高，但却未能与基因表达测定相关联。现有的 Perturb-map 技术，虽结合了转录组学、CRISPR 扰动和空间信息，但存在使用蛋白条形码牺牲优势、空间分辨率受限等问题。因此，开发一种能整合单细胞空间测定和大规模原位读取 gRNA 的工具迫在眉睫。

为此，Broad研究所和波士顿大学的研究人员开发出一种名为 Perturb-FISH 的新技术。该技术巧妙地结合了成像空间转录组学（iST）和 CRISPR 扰动的读数，犹如给细胞研究安装了 “透视镜”，能在单细胞水平解析分子和功能状态。

具体来说，它利用改造后的慢病毒载体，在 gRNA 序列前插入 T7 噬菌体启动子，实现 gRNA 的原位转录扩增，再结合 MERFISH 技术同时检测 gRNA 和 mRNA，从而获取细胞内的遗传和转录信息。

这篇题为“Simultaneous CRISPR screening and spatial transcriptomics reveal intracellular, intercellular, and functional transcriptional circuits”的论文于3月12日发表在《Cell》杂志上。

Perturb-FISH 技术的可行性验证

研究人员首先在 THP1 来源的巨噬细胞对脂多糖（LPS）刺激的反应系统中，验证 Perturb-FISH 技术的可行性。他们用靶向 35 个基因的 gRNA 文库扰动细胞，使其分化为巨噬细胞后用 LPS 刺激。结果表明，Perturb-FISH 实验结果自我一致性良好，与 Perturb-seq 结果高度吻合。例如，NF-κB 通路关键基因（MAP3K7、IRAK1、TRAF6、RELA）的扰动效应在两种技术间相关性极高。这表明 Perturb-FISH 能够像 Perturb-seq 一样，可靠地复原细胞内遗传扰动的影响。

揭示细胞外基因扰动效应

细胞的 “社交生活” 一直是科学家们关注的焦点，Perturb-FISH 技术为研究细胞间相互作用提供了新视角。研究人员发现，THP1 细胞中某些基因的表达对细胞密度有高度依赖性。以 LPS 响应基因 TNF 和 IL1A 为例，TNF 的表达随细胞邻居数量增加而增加，IL1A 则相反。进一步分析发现，许多基因扰动在不同细胞密度下效果差异显著，例如 NFKB1 基因敲除仅在低密度细胞中上调 TNF 表达，而TRAF6 基因敲除对 IL1A 的下调作用在低密度时更强。

此外，Perturb-FISH 还揭示了细胞间的遗传扰动效应，MYD88 基因敲除会使周围细胞中 TNF 和 CD14 表达增加，MAP2K7 扰动则影响周围细胞中多个基因的表达。这些结果揭示了巨噬细胞间的共调节基因网络，凸显了 Perturb-FISH 在研究细胞间遗传相互作用方面的强大能力。

探索自闭症的风险基因网络

自闭症的发病机制一直是医学领域的未解之谜，研究人员尝试用 Perturb-FISH 技术揭开其中的奥秘。他们设计了针对 127 个高度外显的自闭症风险基因的 Perturb-FISH 筛选实验，在人类诱导多能干细胞（hIPSC）来源的星形胶质细胞中进行。

通过刺激细胞并记录钙活性，结合 mRNA 表达分析，发现不同的钙活性表型与特定基因表达谱相关。例如，“高峰值”钙活性表型的细胞中，多个与钙结合和突触功能相关的基因表达改变。同时，研究还确定了影响这些表型的遗传因素，发现某些自闭症风险基因的扰动会使细胞偏向特定的功能表型，且这些基因可聚类成不同模块，影响下游基因表达。这为理解自闭症的发病机制提供了新线索。

探究肿瘤组织中的基因扰动效应

肿瘤的发生发展机制极为复杂，肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用更是其中的关键环节。研究人员在小鼠异种移植模型中应用 Perturb-FISH 技术，研究 NF-κB 通路的基因扰动。他们用靶向 35 个基因的扰动文库处理人类黑色素瘤细胞系 A375，将其注入免疫缺陷小鼠体内。

结果发现，Perturb-FISH 能有效复原细胞内和细胞间的基因扰动效应。在肿瘤细胞中，不同基因扰动对细胞增殖、迁移、DNA 修复等相关基因表达有显著影响；在肿瘤微环境中，还观察到基因表达模式的空间定位和克隆群体的存在；此外，肿瘤细胞的基因扰动会影响邻近 T 细胞的基因表达，如 IRAK1、LBP 或 TAB2 的 KO 会下调 T 细胞激活标记，而 CHUK 和 MAP2K2 的 KO 则会产生相反效果。这些结果为深入理解肿瘤免疫调节机制提供了重要依据。

总的来说，Perturb-FISH 技术不仅能在单细胞分辨率下研究遗传和分子关联，还能揭示传统方法难以发现的细胞内、细胞间以及功能转录调控机制。在研究巨噬细胞对 LPS 刺激的反应中，Perturb-FISH 展示了其在复原细胞内扰动效应方面的可靠性，同时揭示了细胞密度和细胞间相互作用对基因表达的影响，这对于理解免疫反应的调控机制意义重大。

在自闭症风险基因研究中，这项技术将基因扰动与功能表型和转录组联系起来，为探索自闭症发病机制提供了新方向。在肿瘤研究中，Perturb-FISH 揭示了肿瘤细胞与免疫细胞间复杂的相互作用机制，为肿瘤免疫治疗提供了潜在靶点。

研究人员认为，这项技术推动了细胞内和细胞间回路的功能基因组学研究，有望在生命科学和健康医学领域引发更多突破，为攻克疾病带来新的希望。