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本文利用携带 m.3243A>G 突变的 hiPSC 构建肌肉模型，揭示突变影响，为疾病研究和药物筛选提供平台。
### 线粒体疾病研究背景
线粒体肌病通常由核或线粒体编码蛋白的突变引起，以肌肉无力为特征。m.3243A>G DNA 突变是线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作（MELAS）的主要病因。该突变携带者频率为每 10 万人中有 140 - 250 人，但疾病本身的患病率要低得多，许多携带者临床无症状或症状轻微未被识别。目前，对于这种特定突变在终末分化组织中的生化和生理后果知之甚少，且缺乏良好的实验系统用于疾病建模和药物筛选。
研究模型的建立
研究人员从携带 m.3243A>G 突变的患者来源的成纤维细胞中生成了人类诱导多能干细胞（hiPSC），并通过手动选择携带不同突变负荷的克隆，建立了稳定的 hiPSC 系，包括突变负荷为 50%（hiPSC - M50）、90%（hiPSC - M90）和检测不到（hiPSC - M0）的细胞系。这些细胞系在多能性、氧消耗和线粒体膜电位等方面没有差异。
hiPSC 向肌纤维的分化
为了建立能准确再现 m.3243A>G 突变携带者肌肉肌病关键特征的肌肉模型，研究人员采用了一种分化方案。该方案通过组合成纤维细胞生长因子 2（FGF2）和 Wnt 激动剂 CHIR99021，同时抑制骨形态发生蛋白信号，使细胞向中胚层谱系定向分化，随后再诱导其向肌纤维分化。
比较蛋白质组学分析显示，祖细胞和肌纤维在蛋白质表达上存在明显差异，且突变体肌纤维与对照肌纤维之间的差异更为显著。此外，研究还发现，分化后的肌纤维表达了与肌肉成熟相关的蛋白质，如肌球蛋白重链的多种亚型、Junctophilin - 1、LDB3、TNNT1 和 ACTN2 等，同时细胞增殖相关蛋白表达降低。通过染色和显微镜观察发现，肌纤维具有正常的结构和收缩功能，对咖啡因刺激有钙响应，表明细胞重编程未受 m.3243A>G 突变的显著影响。
突变对线粒体生物能量功能的影响
虽然线粒体功能障碍通常被认为会影响细胞分化，但在该体外模型中，突变体肌纤维与对照肌纤维在成肌效率上没有明显差异。不过，突变体肌纤维在某些方面表现出异常，如 Myo - M90 细胞在分化第 10 天的平均细胞直径减小，突变体肌纤维的总蛋白浓度与基因组 DNA 的比值降低，且蛋白质组学分析显示与肌肉相关的异常术语富集。
进一步研究发现，m.3243A>G 突变导致肌纤维的呼吸速率显著降低，线粒体膜电位在高突变负荷（M90）的细胞系中明显下降。电子传递链（ETC）中复合物 I 和 II 的亚基表达减少，导致线粒体 NADH 积累，NADH/NAD+比值升高，同时细胞内乳酸浓度增加，出现乳酸酸中毒，这与 MELAS 患者的症状一致。此外，代谢途径也发生了改变，三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化下调，糖酵解增加。
营养信号通路的改变
由于糖酵解速率增加和 NADH 生成增多，突变体肌纤维中乳酸与丙酮酸的比值升高，反映出细胞质中 NADH/NAD+比值增加，这一结果通过表达基因编码的细胞质 NADH/NAD+传感器 Peredox 得到了证实。同时，参与 NADH 穿梭的蛋白质表达也发生了变化，如甘油 - 3 - 磷酸（G3P）穿梭和苹果酸 - 天冬氨酸穿梭中的相关酶。G3P 穿梭中，细胞质 GPD1 和 GPD1L 的表达随突变负荷增加而增加，而线粒体 GPD2 的表达则相反；苹果酸 - 天冬氨酸穿梭中的 MDH1 表达在突变体中增加，可能是对细胞质中升高的 NADH 水平的一种补偿机制。
代谢重编程激活 PI3K/AKT/mTORC1 轴
研究人员之前发现，在携带 m.3243A>G 突变的成纤维细胞和肌肉活检中，磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）/Akt/mTORC1 通路被组成性激活。在本研究中，通过检测 mTOR 的下游靶标 S6 和 AKT 的磷酸化水平，发现该信号通路在高突变负荷的细胞系中显著上调。比较磷酸化蛋白质组学分析进一步证实了 AKT 和 mTORC1 的激活，表明 m.3243A>G 突变对该模型的营养感知通路产生了不同程度的影响。
研究总结与展望
本研究成功构建了携带 m.3243A>G 突变的 hiPSC 来源的肌肉模型，该模型能够模拟疾病特征，展现出肌纤维的收缩性、线粒体功能障碍以及营养信号通路的改变。研究表明，尽管存在高突变 DNA 水平，但细胞仍能表达肌肉表型。通过该模型，研究人员观察到线粒体膜电位、呼吸作用以及 NADH 积累等关键线粒体变量的变化，这些变化影响了营养感知信号通路。该模型为深入研究 m.3243A>G 突变对细胞生物能量学和肌肉生理学的影响提供了有力工具，有望为开发治疗线粒体疾病的药物提供筛选平台。未来研究可以进一步探讨线粒体异质性在分化过程中的动态变化，以及针对相关信号通路的干预措施对疾病治疗的潜在作用。
