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本文利用核移植技术，发现体内重编程效率存在细胞类型差异，转录记忆影响胚胎发育。
一、研究背景
在再生医学和干细胞生物学领域，将体细胞重编程为其他细胞命运至关重要。体细胞克隆技术，如体细胞核移植（NT）到卵子中或克隆，以及特定转录因子的异位表达，都可实现细胞重编程。然而，由于重编程后细胞转化为功能性、组织整合细胞的效率较低，其临床应用面临挑战。
成功的重编程需要抹去先前的细胞身份并建立新的身份。在分子层面，表观基因组和转录组的变化可能是细胞命运完全转换的关键。已有研究表明，当 NT 胚胎发育失败时，细胞类型的分化缺陷可能源于供体细胞命运的表观基因组和转录组重编程失败。大量转录组分析发现，大多数 NT 胚胎表现出类似于体细胞供体类型的基因表达模式，即转录记忆，这对胚胎发育结局有负面影响。目前，NT 胚胎发育过程中不同细胞类型的分化缺陷尚不清楚，转录记忆在这些缺陷中的作用也不明确。
二、研究方法
- 实验动物与胚胎处理：使用非洲爪蟾（Xenopus laevis）进行实验，其饲养遵循德国动物福利法。收集非洲爪蟾的卵子，进行体外受精（IVF）。从神经胚阶段胚胎的内胚层组织分离供体细胞，移植到去核卵子中生成 NT 胚胎。根据 Faber 和 Nieuwkoop 的标准确定胚胎发育阶段。
- 单细胞相关实验：从 12 期 IVF 和 NT 胚胎中分离表皮组织，制备单细胞悬液。使用 Chromium 10x Genomics 平台生成单细胞文库，并进行测序。对测序数据进行预处理、归一化、批次整合等分析，通过多种方法进行细胞聚类、注释和细胞类型鉴定。利用 CellRank 分析细胞分化动态，确定终端分化状态。
- 基因相关实验：通过差异基因表达分析确定 ON - 记忆基因和 OFF - 记忆基因。使用荧光原位杂交（FISH）和显色原位杂交（WISH）检测基因表达情况。通过注射 mRNA 和吗啉代寡核苷酸（morpholino oligo），分别过表达和抑制特定基因，观察对胚胎发育的影响。
- 其他实验方法：通过免疫组织化学染色检测 Tp63 蛋白，评估基底干细胞（BSC）数量；通过免疫荧光染色检测多种蛋白，分析表皮细胞类型和细胞死亡情况。
三、研究结果
- 克隆胚胎表皮细胞类型分化成功率存在差异：通过单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）分析，在 NT 胚胎和 IVF 胚胎中鉴定出 10 个细胞簇，对应 8 种主要细胞类型。NT 胚胎中混合状态细胞增多，BSC 数量减少。CellRank 分析显示，NT 胚胎内层细胞的分化动态发生改变，“基底干细胞” 和 “神经板边缘” 状态消失，出现新的 “混合状态” 终端群体。这表明一些细胞分化程序在重编程时更易受影响，NT 胚胎发育不成功与特定细胞类型产生失败有关。
- 克隆胚胎中存在转录组重编程效率不均一现象：对 NT 胚胎和 IVF 胚胎的表皮细胞进行分析，发现转录记忆在不同细胞类型中存在差异。混合状态细胞（cluster 9）的 ON - 记忆基因和 OFF - 记忆基因数量最多，转录记忆水平最高。其他一些细胞类型，如水泥腺原基、多纤毛细胞祖细胞和 BSC，也有较多 ON - 记忆基因，且这些细胞类型存在分化缺陷。此外，大多数记忆基因具有细胞类型特异性。
- 内胚层基因表达域在克隆胚胎中异常扩展：在 NT 胚胎中，cluster 9 的细胞同时表达内胚层和表皮层的基因。通过 FISH 和 WISH 实验证实，内胚层关键基因（如sox17b、foxa4等）在 NT 胚胎的表皮中异常表达，且表达域扩展到正常的外胚层区域，这表明 NT 胚胎的正常胚胎体模式受到破坏。
- 克隆胚胎中 BSC 数量减少，表皮祖细胞正常出现：通过 scRNA - seq 数据分析和 WISH 实验验证，发现 NT 胚胎中多纤毛细胞祖细胞、离子细胞祖细胞和杯状细胞的出现频率与 IVF 胚胎相似，但 BSC 数量显著减少，这是 NT 胚胎早期表皮分化中可观察到的第一个缺陷。
- 克隆胚胎中 BSC 减少、表皮成熟缺陷与细胞死亡增加相关：在尾芽期，NT 胚胎中 BSC 数量持续减少，导致成熟 BSC 衍生细胞类型缺失，同时表皮中活化的 caspase - 3 阳性细胞增多，表明细胞死亡增加。这说明克隆胚胎中 BSC 向表皮细胞类型的分化存在缺陷。
- 异位表达 ON - 记忆基因可模拟克隆胚胎的细胞分化缺陷：在受精胚胎中过表达内胚层 ON - 记忆基因（Sox17b 和 Foxa4），结果显示胚胎出现与 NT 胚胎类似的上皮缺陷，包括 BSC 减少、BSC 衍生细胞类型减少和细胞死亡增加，这表明这些 ON - 记忆基因的异常表达可导致克隆胚胎中的上皮缺陷。
- 降低关键内胚层 ON - 记忆基因表达可挽救 NT 胚胎的表皮缺陷：在 NT 胚胎中抑制sox17b基因的表达，可恢复表皮中 BSC 的数量，减少凋亡细胞数量，使胚胎表皮表型恢复正常。这表明 ON - 记忆基因表达是 NT 胚胎异常的主要原因。
四、研究讨论
本研究揭示了体内重编程成功与否具有细胞类型特异性，转录记忆是 NT 胚胎发育缺陷的重要指标和原因。研究发现 NT 胚胎中不同细胞类型的分化成功率存在差异，BSC 在 NT 胚胎中数量减少且分化受损，同时出现了一种新的同时表达表皮和内胚层标记的细胞状态。通过单细胞分析发现 ON - 记忆基因具有细胞类型特异性，主要影响混合状态细胞和 BSC。降低关键转录因子 Sox17b 的表达可提高重编程细胞的分化成功率。
此外，NT 胚胎中 caspase 阳性细胞增多，表明细胞死亡增加。推测重编程效率低、ON - 记忆基因表达高的细胞可能通过细胞竞争被清除。本研究结果有助于深入理解体内细胞重编程及其分子驱动机制，为再生医学提供了重要信息。针对 ON - 记忆基因可能是提高功能性细胞和组织生成的有前景的策略，有望用于替代受损组织。
