编辑推荐：
为解决 AOS 酶底物特异性窄等问题，研究人员对 ThAOS 进行工程改造，拓展其底物范围，为有机合成提供新途径。
研究背景
在有机合成的世界里，碳 - 碳键的形成就像搭建分子大厦的基石，是至关重要的一步。而生物催化方法因其绿色、选择性高和高效的特点，成为科学家们研究的热点。α- 氧代胺合酶（AOSs）作为一类依赖于 5'- 磷酸吡哆醛（PLP）的不可逆碳 - 碳键形成酶，在许多重要生物初级代谢产物的生物合成中发挥着核心作用，比如血红素途径中的 5 - 氨基乙酰丙酸合酶（ALAS）、生物素途径中的 8 - 氨基 - 7 - 氧壬酸合酶（AONS）以及鞘脂生物合成中的丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）等。
然而，AOSs 此前却一直未被充分利用于有机合成领域。这是因为它们存在一些明显的缺陷：底物特异性狭窄，往往只能识别特定的氨基酸和酰基辅酶 A 硫酯底物；而且，酰基辅酶 A 这类底物价格昂贵，这大大限制了 AOSs 在实际生产中的应用。尽管它们具备构建复杂分子结构的潜力，但这些问题使得它们在合成领域的发展举步维艰。为了突破这些困境，让 AOSs 在有机合成中发挥更大的作用，研究人员开展了一系列研究。
爱丁堡大学和纽卡斯尔大学的研究人员针对上述问题，对来自嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）的热稳定 AOS（ThAOS）进行了理性工程改造。研究成果发表在《Communications Chemistry》上，为有机合成提供了新的思路和方法，具有重要的意义。
研究方法
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：
- 定点突变技术：通过对 ThAOS 中特定氨基酸残基（如 Val79）进行定点突变，改变酶的结构，进而影响其底物结合能力和催化活性。
- 酶活性检测技术：采用 DTNB（5,5'- 二硫代双 (2 - 硝基苯甲酸)）检测法，监测 CoASH 的释放，以此来评估 ThAOS 及其变体对不同底物的催化活性。
- 光谱分析技术：利用 UV-vis 光谱分析底物与 ThAOS 的结合情况以及催化过程中关键中间体的形成，为研究酶的作用机制提供了重要依据。
- 晶体结构解析技术：解析 ThAOS V79A 变体与配体 L - 青霉胺（L-Pen）结合的晶体结构，从原子层面揭示酶结构与功能的关系。
研究结果
- 野生型 ThAOS 的底物结合特性：研究人员利用 ThAOS 依赖 PLP 的固有 UV-vis 特性，研究其与氨基酸底物的结合情况。通过 UV-vis 光谱分析发现，甘氨酸（Gly）、L - 丙氨酸（L-Ala）和 L - 丝氨酸（L-Ser）等底物与 ThAOS 结合后，会引起 PLP UV-vis 光谱的变化，这表明这些底物能与 ThAOS 形成 PLP: 氨基酸外部醛亚胺。并且，L-Ala 结合会导致少量 PLP:L-Ala 醌亚胺的形成。当加入第二个底物乙酰辅酶 A 后，不同底物组合产生了不同的光谱变化，这暗示 ThAOS 可能比之前认为的能结合更多种类的底物12。
- ThAOS 的理性工程改造扩大底物范围：基于对 ThAOS 晶体结构的分析，研究人员发现 Val79 残基与底物氨基酸侧链距离较近，可能对氨基酸底物选择性有重要影响，于是对其进行定点突变。在测试的 33 种氨基酸底物中，ThAOS V79A 和 ThAOS V79G 变体表现出对 16 种氨基酸的活性，包括 9 种非天然氨基酸（UAAs）和 7 种蛋白质源性氨基酸。这两种变体对原始的 4 种氨基酸底物（L-Aba、L-Ala、Gly 和 L-Ser）的催化效率相较于野生型有显著提高，其中 ThAOS V79G 在大多数情况下比 ThAOS V79A 更快。此外，通过定点饱和突变获得的其他变体，如 ThAOS V79S，也表现出对特定底物的活性增强34。
- ThAOS V79 变体扩大酰基辅酶 A 底物范围：研究人员进一步研究了 Val79 变异对酰基辅酶 A 硫酯底物范围的影响。结果显示，ThAOS V79G、V79A 和 V79S 变体在 C2-C8 链长范围内保留了与野生型 ThAOS 相似的酰基辅酶 A 底物范围，并且 ThAOS V79G 还能与 C10 和 C12 酰基辅酶 A 底物反应，ThAOS V79S 能催化非天然氨基酸底物 L-Pra 与 C2-C8 酰基辅酶 A 的缩合反应56。
- ThAOS V79G 变体的酰基辅酶 A 非依赖醌亚胺形成：ThAOS V79G 变体在与多种氨基酸底物孵育时，能形成 PLP: 氨基酸醌亚胺中间体，且在加入乙酰辅酶 A 后，该中间体的信号增强。这表明 ThAOS V79G 变体可以在没有酰基辅酶 A 底物的情况下生成关键的醌亚胺中间体，改变了酶的催化机制，使其对底物的要求更加宽松7。
- ThAOS V79 变体的热稳定性和光谱性质：研究人员对 ThAOS V79 的四个变体（V79A、V79G、V79L、V79S）进行热稳定性研究，发现 ThAOS V79A 在高温下（如 90°C 孵育 120 分钟后）仍能保留约 60% 的活性，表现出较好的热稳定性。综合考虑底物范围和热稳定性，研究人员选择 ThAOS V79A 进行后续的放大合成实验89。
- ThAOS V79 变体可使用替代底物乙酰 - SNAc：由于酰基辅酶 A 价格昂贵，研究人员尝试用价格更便宜的 N - 乙酰半胱胺（SNAc）硫酯替代。实验结果表明，野生型 ThAOS 与乙酰 - SNAc 没有可检测到的活性，而 ThAOS V79A、V79G 和 V79S 变体均表现出与乙酰 - SNAc 的反应活性。其中，ThAOS V79A 在 60°C 下与甘氨酸和乙酰 - SNAc 反应，能以 35% 的产率生成吡咯，展示了该变体在使用廉价底物进行有机合成的潜力1011。
- ThAOS V79A 与 L-Pen 结合的晶体结构：研究人员成功解析了 ThAOS V79A 与 L-Pen 结合的晶体结构。结构显示，L-Pen 的胺基与 PLP 辅因子共价连接，底物羧酸盐由 Arg366 螯合。与野生型 ThAOS 相比，ThAOS V79A 的活性位点没有明显的结构变化，但去除 Val79 侧链增加了配体结合位点的体积，这为解释变体底物范围扩大的原因提供了结构基础1213。
研究结论与意义
本研究通过对 ThAOS 的理性工程改造，成功获得了具有更广泛底物范围的变体。这些变体不仅能够使用多种天然和非天然氨基酸底物，还能利用简单且廉价的乙酰 - SNAc 硫酯底物，大大拓展了 AOS 在有机合成中的应用潜力。并且，研究发现 ThAOS V79 变体可以在没有酰基辅酶 A 的情况下形成关键的醌亚胺中间体，改变了 AOS 的催化机制。
从晶体结构角度，ThAOS V79A 变体与 L-Pen 结合的晶体结构为理解变体的催化特性提供了分子层面的依据。这一系列研究成果为 AOS 家族成员作为合成有用的碳 - 碳键形成生物催化剂开辟了新道路，就像为有机合成领域打开了一扇新的大门，有望推动相关领域的发展，在未来的化学合成、药物研发等方面发挥重要作用。同时，也为其他生物催化剂的改造和优化提供了宝贵的经验和参考，鼓励科研人员进一步探索生物催化在有机合成中的更多可能性。
