非抑制性适配体靶向CRL2ZYG11B E3连接酶：开辟蛋白质靶向降解新策略

编辑推荐：针对E3连接酶资源匮乏制约PROTAC发展的难题，山东师范大学联合天津医科大学团队通过SELEX筛选获得特异性结合CRL2ZYG11B的非抑制性DNA适配体Apt#Z6，构建出新型ZATAC降解平台，成功降解NCL、SOX2和p53-R175H等难成药靶点，其创新的三向连接体（3WJ）设计更实现肿瘤特异性递送与双靶降解，为拓展靶向蛋白降解技术提供全新工具。

　　

在生物医药领域，靶向蛋白降解技术（PROTAC）正掀起一场治疗革命。这种通过劫持细胞自身的泛素-蛋白酶体系统来特异性清除致病蛋白的策略，为传统"不可成药"靶点带来了曙光。然而，这场革命却面临着一个关键瓶颈——目前仅有约2%的E3泛素连接酶被成功应用于PROTAC开发，且临床前研究已发现对常用CRBN和VHL系统的耐药机制。更令人担忧的是，E3连接酶与靶蛋白的匹配程度直接影响降解效率，这就像锁匠手中只有两把万能钥匙，却要打开数百把不同的锁。

面对这一挑战，山东师范大学与天津医科大学的研究团队将目光投向了CRL2^ZYG11B——一个能识别N端甘氨酸降解信号（Gly/N-degron）的Cullin 2-RING E3连接酶复合物的底物受体。这项发表在《Nature Communications》的研究创新性地采用DNA适配体（又称"化学抗体"）作为分子胶水，开发出全新的靶向降解平台ZATAC，为PROTAC技术解锁了新的E3连接酶资源。

研究团队首先通过磁珠SELEX（指数富集配体系统进化）技术进行七轮筛选，从随机DNA文库中淘选出了特异性结合ZYG11B的适配体Apt#Z6。等温滴定量热法（ITC）显示其解离常数K_d=4.69±2.19 μM，表面等离子共振（SPR）和微量热泳动（MST）进一步验证了结合特异性。尤为关键的是，这种适配体如同"不插手的媒人"——通过泛素全局蛋白稳定性（GPS）报告系统证实，Apt#Z6不会干扰ZYG11B对其天然底物（如JAK2）的降解功能，这使其成为理想的PROTAC组件。

关键技术方法

研究采用SELEX筛选ZYG11B特异性适配体，通过ITC、SPR和MST验证结合特性；利用生物正交化学构建Halo-ZATAC，并通过20%天然PAGE确认连接效率；采用3WJ框架构建三特异性ZATAC，借助免疫共沉淀和质谱分析验证三元复合物形成；建立A549异种移植瘤模型评估体内分布与疗效，使用免疫组化分析靶蛋白降解情况。

研究结果

非抑制性DNA适配体的鉴定

通过比较第五轮和第七轮筛选的保留率发现富集趋于饱和（图1b）。质谱分析显示biotin-Apt#Z6特异性捕获80 kDa条带，经鉴定为ZYG11B（附表2）。共聚焦显微镜观察到Cy3标记的Apt#Z6与GFP-ZYG11B在HEK293T细胞中共定位（附图1f），而对照实验证实其不与同源蛋白ZER1结合（附图1e）。

适配体作为降解平台的可行性验证

将DBCO修饰的HaloTag配体与Apt#Z6通过点击化学偶联，发现含3-5个胸苷酸（T_n）连接子的Halo-ZATAC#T3/T5能有效降解GFP-HaloTag（图2c），DC₅₀达44.15 nM（图2g）。蛋白酶体抑制剂MG132处理或ZYG11B敲除均可阻断降解（图2k-p），而溶酶体抑制剂氯喹（CQ）无效，证实其依赖CRL2^ZYG11B-蛋白酶体途径。

双特异性ZATAC的肿瘤治疗潜力

将抗癌适配体AS1411（靶向核仁素NCL）与Apt#Z6通过20 bp柔性DNA连接子组装，获得的NCL-ZATAC#20展现正协同效应（α>1），其与GFP-NCL的K_d^ternary（259 nM）较K_d^binary（668 nM）显著降低（图3c）。在MCF-7乳腺癌细胞中，NCL-ZATAC#20以DC₅₀=158 nM降解内源性NCL（图3g），并延长CHX处理的蛋白半衰期（图3j）。质谱检测到23个显著下调蛋白，其中多数参与翻译调控和DNA代谢（附图5g），这与NCL的生物学功能一致。

攻克"不可成药"靶点的突破

针对转录因子SOX2设计的SOX2-ZATAC#20在A549肺癌细胞中实现剂量依赖性降解（图4c），EdU实验显示其显著抑制细胞增殖（图4j）。更引人注目的是，利用前期开发的p53-R175H突变体特异性适配体p53-mDA构建的R175H-ZATAC#25，在H1299-R175H细胞中有效清除这一致癌突变蛋白（图5d），3D肿瘤球实验证实其抑制效果（图5n）。

三向连接体的精准递送系统

基于DNA三向连接体（3WJ）框架设计的3WJ-ZATAC#T10整合了AS1411（靶向膜结合NCL）和SOX2适配体（图6a）。活细胞成像显示Cy3-3WJ-ZATAC#T10被A549细胞有效内化（图6c），且能同时降解SOX2和NCL（图6d）。将递送模块替换为靶向PTK7的Sgc8c适配体后，3WJ-ZATAC-PTK7同样实现双靶降解（图6k）。在荷瘤小鼠中，Cy5标记的3WJ-ZATAC#T10显示肿瘤特异性分布（图7a），治疗组肿瘤体积显著减小（图7d），免疫组化证实靶蛋白降解并伴随Ki67减少和BAX增加（图7h）。

结论与展望

这项研究开创性地将适配体技术引入E3连接酶开发，其