### 神经母细胞瘤（NBL）概述
神经母细胞瘤（NBL）是儿童最常见的颅外实体瘤，在 15 岁以下儿童中，美国每年的发病率为每 100 万人中有 10.2 例，在婴儿中更为常见。它约占所有儿童癌症的 8 - 10%，却导致了 15% 的儿童癌症相关死亡。NBL 临床症状、发病机制和预后差异很大，高风险（HR）NBL 患者约占所有 NBL 病例的 50%，预后最差，5 年无事件生存率（EFS）仅为 51%，而低风险或中风险病例的 5 年 EFS 接近 90%。
目前 NBL 的标准治疗方法包括手术切除肿瘤、全身化疗、放疗、使用异维 A 酸的分化治疗、自体造血干细胞移植和免疫治疗。然而，尽管治疗手段不断进步，仍有部分 HR - NBL 患者因耐药无法获得最佳治疗效果。
NBL 存在多种常见的基因改变，如 MYCN 基因在 2p24 染色体上的扩增，是肿瘤快速生长的重要生物标志物；还有 1p、3p、11q 染色体臂的缺失和 1q、2p、17q 染色体臂的增加等节段性染色体畸变，也具有预后意义。其中，间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因的激活突变是 NBL 中最常见的突变类型，在散发性 NBL 中，体细胞 ALK 突变在各风险组中的发生率为 6% - 17% 。ALK 基因已成为肿瘤治疗的重要靶点，其相关研究对 NBL 的治疗意义重大。
ALK 基因与蛋白结构及功能
ALK 基因（NM_004304.5）位于 2 号染色体的 2p23.2 - p23.1 区域，在 GRCh38/hg38 人类基因组组装中，其基因组坐标为 2:29,192,774 - 29,921,586（反向链），共有 29 个编码外显子，编码一个由 1620 个氨基酸组成的蛋白质。
ALK 蛋白结构包含细胞外、跨膜和细胞内结构域。细胞外结构域由 2 个 MAM 结构域（分别为 meprin、A - 5 蛋白和受体蛋白 - 酪氨酸磷酸酶 mu）环绕一个低密度脂蛋白受体 A 类（LDL）结构域构成，其具体功能尚未完全明确，推测 MAM 结构域可能参与细胞间相互作用，LDL 结构域通常与配体结合。细胞内结构域含有酪氨酸激酶（TK）结构域，NBL 中的 ALK 突变就发生在该区域。
ALK 基因编码的酪氨酸激酶受体主要在中枢和外周神经系统发育过程中表达，属于胰岛素受体家族的一个亚家族，在正常发育过程中对交感神经节的形成发挥作用。其天然配体包括多效生长因子（PTN）和中期因子（MK）。PTN 在多种肿瘤中过度表达，可作为肿瘤生长因子，刺激内皮细胞增殖，促进血管生成；MK 在大脑发育早期对神经突之间连接的形成至关重要，在成年后主要在肠道表达，在其他器官也有低水平表达。MK 还参与调节胎儿发育和器官形成过程中的上皮 - 间质相互作用，并且能抑制小鼠大脑皮层原代神经元培养中的细胞凋亡，可能在促进肿瘤细胞的存活和侵袭方面发挥作用 。
在多种儿科癌症中，ALK 蛋白常常被激活，如间变性大细胞淋巴瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、横纹肌肉瘤和 NBL 等。与在淋巴瘤和肺癌中检测到的 ALK 融合基因不同，NBL 主要表现为 ALK 突变和扩增，而非基因融合。在 NBL 中，大多数 ALK 突变是激活型错义单核苷酸变异（SNVs），导致 ALK 受体细胞内酪氨酸激酶结构域的氨基酸替换，破坏 ALK 激酶的天然抑制结构，使激酶活性增加，进而促进肿瘤的生长、增殖和迁移。此外，ALK 还可通过基因组局灶性扩增被激活，这种情况几乎总是与 MYCN 扩增相关，而 ALK 易位在 NBL 中较为罕见 。
ALK 突变类型与热点
研究发现，NBL 中 85% 的 ALK 突变集中在三个主要热点残基：R1275、F1174 和 F1245。其中，R1275 突变最为常见（43%），其次是 F1174（30%），F1245 相对较少（12%）。这些热点位于受体酪氨酸激酶结构域的关键调节区域，对 ALK 的激活和转化具有重要作用。
具体的突变形式包括 R1275 被谷氨酰胺或亮氨酸取代，F1174 被亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸或丝氨酸取代，F1245 被亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或半胱氨酸取代。例如，R1275Q 突变会破坏自抑制相互作用，从而激活 ALK。除了这三个热点突变，还在其他 15 个位置发现了单碱基替换，如 G1128、M1166、I1171 等。临床前研究表明，这些 ALK 酪氨酸激酶结构域内的单核苷酸变异能够激活致癌信号通路。
不同的 ALK 突变对疾病的影响存在差异。其中，ALK F1174L 突变与更具侵袭性的疾病表型相关，并且对某些 ALK 抑制剂具有抗性，导致临床治疗效果不佳。在转基因小鼠模型中，同时表达 ALK F1174L 和 MYCN 扩增的模型相比仅 MYCN 扩增的模型，肿瘤潜伏期缩短，肿瘤更大更具侵袭性。在一项小鼠实验中，过表达 ALK F1174L 和 MYCN 癌基因的小鼠，NBL 发病更早、发病率更高且致死率增加，这表明突变的 ALK 通过激活信号通路稳定 MYCN 蛋白，对抗其促凋亡作用，从而加速肿瘤发生。
此外，在使用酪氨酸激酶抑制剂（TKI）如克唑替尼时，ALK 更倾向于与克唑替尼结合而非 ATP。但 ALK 的 F1174L 突变与 R1275Q 激活突变相比，会削弱自抑制相互作用，使酪氨酸激酶结构域获得活性构象，增强与 ATP 的结合亲和力，从而导致对克唑替尼的抗性。在接受克唑替尼治疗的 ALK 易位 NBL 患者中，F1174L 突变已成为逃避药物作用的一种机制。
值得注意的是，胸 NBL 的预后比肾上腺 NBL 好，且 ALK 突变在胸 NBL 中更为常见（16.2% 对 9.3%），尤其是在 MYCN 未扩增的病例中。同时，年龄小于 1.5 岁的 4 期患者中 ALK 点突变频率最高。
ALK 在家族性 NBL（种系突变）中的作用
家族性 NBL 病例约占所有 NBL 病例的 1 - 2%。研究发现，在种系样本中存在 PHOX2B 和 ALK 基因的常染色体显性错义突变，其中 ALK 基因的常染色体显性功能获得性突变在约 50% 的家族性 NBL 病例中被报道。
这些遗传性病例通常在较早年龄被诊断出来，可能出现多个原发性肿瘤，并且具有癌症易感综合征的临床特征，这与散发性 NBL 病例有所不同。一项针对有至少两名亲属患 NBL 家族的研究发现，ALK 基因突变占家族性 NBL 病例的大部分（约 75%），并且在五个家系的受影响个体的种系 DNA 中检测到 R1275Q 突变，该突变位于激酶激活环，与多种蛋白激酶（如 BRAF）的激活突变相关，因此 ALK 基因的种系功能获得性突变被认为是家族性 NBL 的主要易感因素。
ALK 扩增
除了点突变，ALK 还可通过基因组局灶性扩增被激活，这种情况在约 2 - 10% 的 HR - NBL 中出现。研究显示，ALK 扩增通常与 MYCN 扩增同时出现，很少与 ALK 点突变同时发生，仅有少数例外。携带 ALK 扩增的患者预后较差。
由于 ALK 和 MYCN 在 2 号染色体上位置相近，分别位于 2p23 和 2p24，两者之间存在密切关联。有研究认为 MYCN 能够激活 ALK，进而增加 MYCN 的转录和稳定性，但具体机制在文献中尚未广泛讨论。一种可能的解释是 ALK 和 MYCN 通过激活磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）信号通路，共同促进癌症生长，该通路有助于稳定和增加 N - MYC 蛋白的水平。
在对 Gesellschaft für P?diatrische Onkologie（GPOH）患者的纵向研究中发现，ALK 扩增仅在 HR 肿瘤中检测到，且仅在伴有 MYCN 扩增的肿瘤中出现。与无 ALK 扩增的患者相比，ALK 扩增患者的总生存期（OS）更差。同时，ALK 扩增在年轻患者和诊断时为国际神经母细胞瘤分期系统（INSS）3 期的 NBL 中更为常见。
ALK 突变（克隆性与亚克隆性）
肿瘤突变可分为克隆性突变和亚克隆性突变。克隆性突变是指突变细胞优于其他细胞，形成一群都携带相同突变的细胞群体；而亚克隆性突变会导致肿瘤内的多样性，不同细胞获得不同突变，多种亚克隆共存并独立进化，造成肿瘤内异质性。检测局限于亚克隆的临床显著突变具有挑战性，即使使用高灵敏度和准确性的基因组技术，也可能因为这些突变的拷贝数较低而难以发现。通常将突变等位基因分数大于 20% 的 ALK 突变定义为克隆性水平突变，0.1% - 20% 的定义为亚克隆性突变。
ALK 激活突变主要发生在激酶结构域的特定热点位置，如 F1174、R1275 和 F1245，这些突变可在克隆性或亚克隆性水平上出现。由于亚克隆性突变的等位基因分数较小，且活检只能获取肿瘤的一部分，可能无法涵盖所有 ALK 突变区域，因此在小活检样本中存在遗漏某些基因组改变的风险。
在初诊时存在 ALK 突变亚克隆，意味着肿瘤中同时存在未突变和突变的 ALK 细胞，这种共存可能形成一种平衡状态，对癌症的后期进展产生重要影响。肿瘤细胞不同亚群之间的协作是恶性癌症表型发展的一个因素。在复发或进展的 NBL 中，7% 的病例发现了新的 ALK 突变，这可能是由于诊断时存在的携带 ALK 突变的小亚克隆在治疗后扩增，成为复发时的优势克隆。研究表明，肿瘤亚克隆的进化与获得性耐药相关的致癌特征的出现有关，一些特征在治疗前就存在于亚克隆中，化疗后成为优势特征，体现了耐药表型的选择过程。
在 HR - NBL1 试验中，对 571 例有 ALK 扩增（ALKa）和 ALK 突变（ALKm）状态信息的病例分析发现，ALKa 或克隆性 ALKm 病例与亚克隆性 ALKm 或无 ALK 改变病例之间的总生存期（OS）存在显著差异。这表明需要一种能够适应 ALK 阳性 NBL 不断变化特性的靶向治疗方法，帮助肿瘤学家选择更有效的靶向治疗药物，降低耐药风险。
ALK 改变与复发的关联
NBL 中复发特异性 ALK 突变的发现与治疗耐药相关，这凸显了在肿瘤进展时评估 ALK 状态的重要性。研究发现，在复发的 NBL 病例中，17.7% 检测到 ALK 单核苷酸变异（SNVs），HR 和非 HR 患者在复发时的突变频率没有显著差异。对疾病过程中 ALK 突变变化的分析显示，整个队列在复发时 ALK SNVs 显著增加，约 7% 的复发或进展 NBL 病例可能出现新的 ALK 突变。另一项研究对 54 对 NBL 样本进行检测，发现 ALK 突变频率从诊断时的 16.7% 上升到复发时的 25.9%，深度基因组测序仅在 3.7% 的复发病例中发现新的 ALK 突变，部分 ALK 突变在诊断时就已存在于亚克隆水平。因此，在诊断时不能排除存在于小亚克隆或活检样本之外肿瘤区域的突变。
值得注意的是，在 NBL 治疗过程中，特定的基因改变可能被选择或出现。亚克隆驱动突变可能促进肿瘤进展，诊断时携带驱动突变的亚克隆在复发时的扩增与不良预后相关。在复发的 NBL 中，最常见的突变是 R1275Q，其在复发时的高频率可能是由于在疾病过程中从头发生。对于诊断时检测到 ALK 扩增的患者，复发时未发现新的扩增，且诊断和复发时的 ALK 扩增频率没有差异，因此在复发疾病中评估 ALK 扩增可能并非必要。
ALK 检测方法
- ALK 突变检测：免疫组织化学（IHC）和聚合酶链反应（PCR）测序可用于检测 NBL、神经节神经母细胞瘤和神经节细胞瘤样本中的 ALK 突变状态。研究发现，通过 PCR 检测，72 例 NBL 样本中有 2 例、12 例神经节神经母细胞瘤样本中有 2 例存在 ALK 突变；而通过 IHC 检测，约一半的 NBL 样本呈 ALK 阳性，但 ALK IHC 检测结果不能用于诊断 NBL 中的 ALK 突变，因为它是一种与突变无关的特征。
在儿童肿瘤协作组（COG）的 ANBL12P1 试验中，采用桑格测序和荧光原位杂交（FISH）来确定 ALK 突变和扩增状态。传统上，COG 试验中通过对 ALK 酪氨酸激酶结构域（外显子 21 - 28）进行桑格测序来评估肿瘤的 ALK 状态。然而，该技术只能在不到 15% 的 HR 疾病患者肿瘤中识别 ALK 酪氨酸激酶的激活突变。
近年来，下一代测序（NGS）成为检测 ALK 突变的首选方法。与桑格测序相比，NGS 能够检测到低变异等位基因频率（VAF）的 ALK 突变，而桑格测序只能识别克隆水平的突变。回顾性分析显示，3.9% 新诊断的 HR - NBL 患者肿瘤中存在 VAF 低于 20% 的 ALK 突变。一些研究采用深度测序，因其比桑格测序具有更高的灵敏度。在对 GPOH 的 125 个样本的研究中，双脱氧测序和更敏感的方法（如 NGS 或液滴数字 PCR，ddPCR）在 99.2% 的病例中结果一致，双脱氧测序甚至能检测到等位基因分数低于 5% 的 ALK 突变，但未来研究仍应优先选择基于 NGS 的方法诊断 ALK 突变，因为其能提供全面的遗传信息、高灵敏度并准确确定突变的等位基因分数，不过样本中肿瘤细胞含量低和肿瘤内遗传改变的空间异质性可能会影响 ALK 改变检测的灵敏度。
ALK 扩增检测：荧光原位杂交（FISH）、阵列比较基因组杂交（aCGH）、多重连接聚合酶链反应和阵列单核苷酸多态性等方法可用于评估 ALK 扩增状态，目前 FISH 仍是检测患者肿瘤中 ALK 扩增的首选方法。
液体活检检测：由于儿童获取组织活检存在诸多挑战，如可行性、缺乏连续监测以及可能无法捕捉区域异质性等，液体活检成为一种有潜力的替代方法。研究发现，对 NBL 患者进行液体活检获取的循环肿瘤 DNA（ctDNA）分析，能够提供肿瘤基因组变化的实时信息，并识别治疗耐药的早期发展。将纵向 ctDNA 活检与治疗反应的影像学评估相结合，有助于深入了解肿瘤随时间的动态变化。
ALK 抑制剂的应用（新旧一代对比）
2008 年发现 NBL 中的 ALK 异常后，针对 ALK 的临床前和临床试验不断开展。ALK 抑制剂最初是为成人癌症开发的，其出现加速了 NBL 靶向治疗的发展。ALK 抑制剂属于小分子酪氨酸激酶抑制剂，能够特异性靶向 ALK 的酪氨酸激酶活性，克唑替尼是其中一种，它在 ATP 结合口袋处与 ATP 竞争，选择性靶向 ALK 和 Met 受体酪氨酸激酶。
在临床研究中，克唑替尼在人体中安全性良好且耐受性较高，对非小细胞肺癌（NSCLC）ALK 易位患者的治疗产生了显著影响，在 ALK 突变驱动的 NBL 临床前模型中也显示出有效性，并于 2011 年获批用于治疗 ALK 阳性 NSCLC。然而，长期使用克唑替尼和其他酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）会出现耐药问题。
COG 的 ADVL0912 1/2 期临床试验于 2009 年启动，旨在招募复发或难治性 NBL 患者并使用克唑替尼治疗，后来克唑替尼通过 COG ANBL1531 试验被纳入 NBL 一线治疗。同时，第二代和第三代 ALK 抑制剂如塞瑞替尼和劳拉替尼也在 1/2 期试验中进行测试。
ADVL0912 试验表明，克唑替尼对特定类型的 ALK 突变 NBL（如 R1275Q 突变）有效，在存在种系突变（ALK 可能是疾病的初始突变）时也有一定益处，但作为 NBL 的单一治疗药物，对其他体细胞热点 ALK 突变或扩增的效果并不显著。临床前研究显示，ALK 激酶结构域存在特定激活点突变的 NBL 对克唑替尼抑制的反应不同，F1174 和 F1245 位点的突变（占 NBL 中 ALK 异常的 42%）使肿瘤对克唑替尼具有固有抗性。虽然将克唑替尼与传统化疗相结合可能克服对第一代 ALK 抑制剂的耐药性，但仍需要一种对 NBL 中各种 ALK 突变具有更高效力和选择性的 ALK 抑制剂。
劳拉替尼是一种有效的第三代 ALK 抑制剂，属于大环 ATP 竞争性抑制剂，具有相对较小的分子量，能够结合激酶铰链区，具备良好的药代动力学特性。与克唑替尼相比，劳拉替尼穿透中枢神经系统（CNS）的能力更强，这对 NBL 患者尤为重要，因为尽管 NBL 中枢神经系统复发不常见，但仍存在风险。
COG 的 ANBL1531 3 期研究于 2018 年开始，旨在为新诊断的 ALK 阳性 HR - NBL 儿童<添加强化治疗中加入 alk 抑制剂治疗，之后该研究修改方案，用劳拉替尼替代克唑替尼。同时，siopen 修改了 hr nbl2 试验，将劳拉替尼纳入针对 alk 异常参与者的一线治疗。劳拉替尼专门针对因第一代和第二代 alk 抑制剂治疗而产生的突变所激活的 alk，临床前研究表明其对 nbl 的效力比克唑替尼及其他测试的 alk 抑制剂强得多，有效剂量比克唑替尼低 10 - 30 倍，还能克服 nbl 特异性 alk>
在针对携带 F1174 或 F1245 突变（在临床前和临床研究中对克唑替尼耐药）的 NBL 患者来源的异种移植（PDX）模型中，劳拉替尼展现出显著的单药活性；在 R1275Q 异种移植模型中，劳拉替尼也能维持疗效，而克唑替尼通常无法产生持续反应。2017 年 9 月，新神经母细胞瘤治疗方法联盟（NANT）启动了劳拉替尼的 1 期临床试验，用于治疗 ALK 突变驱动的难治性或复发性 NBL 儿科患者。与克唑替尼相比，成人和儿科 1 期研究均表明劳拉替尼毒性更低，对肾功能无负面影响。
对 ALK 抑制剂的耐药性及其他潜在靶点
在 NSCLC 中，约 30% 的 ALK 靶向药物耐药病例是由 ALK 融合基因内的突变引起的，此外，旁路通路的激活和 ALK 基因拷贝数的增加也可能导致耐药。这些在疾病进展过程中发生的动态变化强调了对肿瘤进行重新活检和反复评估 ALK 状态的重要性，不仅对于初始 ALK 阳性的患者（因为在使用 ALK 酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）如克唑替尼治疗过程中可能出现耐药突变），对于疾病过程中出现激活型 ALK 突变但之前未接受过 ALK TKIs 治疗的患者同样如此。不同的 ALK TKIs 与 ALK 激酶结构域的 ATP 结合口袋结合方式略有不同，接触点也存在差异。临床证据显示，使用不同的 ALK TKIs 治疗时会出现不同模式的耐药突变。
耐药突变既可能是治疗引发的，也可能在治疗前就以亚克隆形式存在于肿瘤中，在 ALK TKI 治疗的选择压力下，这些亚克隆会扩增。NSCLC 患者接受 ALK TKIs 治疗时出现的一些耐药突变与 NBL 患者的点突变存在重叠，如 F1174 和 F1245 位点突变。因此，探索其他能够辅助增强 ALK 抑制效果的靶点对于抑制肿瘤生长至关重要。
MYCN 是一个有潜力的治疗靶点，目前尚无直接靶向 MYCN 的临床可用药物，但已有多种策略间接靶向 MYCN 及其转录产物，主要包括阻断 MYCN 的稳定性、使用转录抑制剂或利用合成致死相互作用。MYC 家族癌蛋白的稳定性通过保守的 T58 和 S62 残基的修饰磷酸化得以维持。PI3K/Akt 通路在 NBL 中通过调节 GSK3β 和 mTOR 来调控 MYCN 的磷酸化，因此该通路可作为药物抑制的靶点，间接使 MYCN 不稳定。在对经过基因修饰稳定 MYCN 或表达野生型 MYCN 的 NBL 细胞进行化学遗传学筛选时，PI3K/mTOR 抑制剂 NVP - BEZ235 对稳定 MYCN 的细胞生长具有显著抑制作用，在实验室和动物模型中也证实了其对 MYCN 的抑制效果。虽然 NVP - BEZ235 目前尚未成为临床候选药物，但 PI3K/mTOR 抑制剂 SF1126 已被纳入儿童复发或难治性 NBL 的临床试验。
将劳拉替尼与 MDM2 抑制剂（如 idasanutlin）联合使用是一种有望克服对劳拉替尼耐药性的策略。该联合疗法通过抑制 MDM2，激活 p53 的功能活性，在包括体外、体内和体内模型在内的神经母细胞瘤研究中取得了令人鼓舞的结果，显示出 ALK 抑制和 MDM2 靶向之间的协同效应，值得进一步探索作为儿童神经母细胞瘤的潜在临床治疗方法。
近期研究发现，SHP2 抑制剂能够有效对抗 ALK 靶向治疗在 ALK 重排肺癌中的耐药性。在针对 ALK 驱动的神经母细胞瘤的体外和体内模型研究中，评估了 SHP2 抑制剂 TNO155 单独使用以及与 ALK 抑制剂克唑替尼、塞瑞替尼或劳拉替尼联合使用的效果。结果显示，ALK 突变的神经母细胞瘤细胞系对 TNO155 的 SHP2 抑制作用比野生型细胞系更敏感，且对劳拉替尼耐药的 ALK - F1174L 神经母细胞瘤细胞在 RAS - MAPK 通路存在进一步改变，使用 TNO155 处理后可使这些细胞对劳拉替尼重新敏感。这表明将 SHP2 抑制剂与 ALK 抑制剂联合使用，能够有效靶向 ALK 突变的神经母细胞瘤，包括对 ALK - TKI 疗法产生获得性耐药的病例，为患者提供了新的治疗选择，有望改善对具有 RAS/MAPK/SHP2 通路多种基因变化的神经母细胞瘤及其他实体瘤的治疗效果，提高药物敏感性并解决单药治疗的耐药问题。
此外，研究发现 NF1 缺失或 NRASQ61K 突变会导致 NBL 对 ALK 抑制剂产生耐药性，而 NF1 缺失的 ALK 抑制剂耐药 NBL 细胞对 MEK 抑制剂更为敏感，这提示耐药突变的出现可能揭示新的治疗靶点，为联合治疗方案的设计提供思路。不过，大多数未经治疗的 NBL 细胞对 MEK 抑制剂仅表现出中等敏感性，这与 MEK 抑制剂在 NBL 临床试验中的失败结果相符，但 NF1 敲除模型对 MEK 抑制剂治疗的敏感性有所提高。
结论
2008 年 Mosse 等人发现 NBL 中的 ALK 基因，为 HR - NBL 的治疗带来了重大进展。15 年后，ALK 抑制剂的发展及其正在进行的 3 期临床试验取得了令人瞩目的成果，确立了 ALK 作为 NBL 有效治疗靶点的地位。然而，对 ALK 结构、发生率、潜在有效靶点和耐药机制的深入研究表明，仍需克服对 ALK 抑制剂的耐药问题。
未来的试验应致力于寻找能够补充 ALK 抑制作用的其他靶点，以提高治疗效果。同时，利用循环肿瘤 DNA 作为一种非侵入性手段，对 ALK 阳性 NBL 患者进行纵向随访，并结合影像学评估治疗反应，有助于深入了解肿瘤随时间的动态变化。通过进一步探索这些方向并应对耐药挑战，ALK 靶向治疗在 NBL 领域有望显著改善患者预后。持续的研究和临床探索对于优化 ALK 抑制剂的使用、开发克服耐药性的联合治疗方案至关重要，最终将为 ALK 阳性 NBL 患者带来更好的治疗策略和治疗效果。
