Improved Cohesin HiChIP Protocol: Unveiling the Mysteries of Chromatin Architecture

为解决染色质接触检测及数据分析问题，研究人员开展 cohesin HiChIP 实验研究，优化了实验方案及分析流程，意义重大。

　　

染色质构象研究的新突破：改良的 cohesin HiChIP 技术

在微观的细胞世界里，基因组的折叠与包装是一项极其精妙的 “工程”。大约两米长的人类 DNA，要被高效地塞进直径只有几微米的细胞核中，这一过程不仅关乎结构的搭建，还与细胞核内的 DNA 复制、转录、修复等基础生命活动紧密相连。然而，尽管近年来 3D 基因组学取得了不少进展，但人们对于基因组结构与功能之间的关系，仍然知之甚少。

目前，研究 DNA 在细胞核中的结构主要依靠基于 3C 的技术和显微成像方法。这些研究发现，哺乳动物的染色质在细胞核中呈现出不同层次的组织形式。在较小的尺度上，间期染色体占据着细胞核内离散的区域，称为染色体领地；它们又被划分为两种类型的交替多兆碱基区域，即 A 和 B 隔室，分别对应常染色质和异染色质。在隔室内，10nm 的染色质纤维折叠成环，连接着线性基因组中可能相距较远的元件，如启动子和增强子。部分染色质环还会形成更大的结构，即拓扑相关结构域（TADs）。而在这一系列复杂的结构形成过程中，cohesin 蛋白复合体和 CTCF 蛋白起着关键作用。

为了深入探究染色质的奥秘，来自华沙大学（University of Warsaw）和华沙理工大学（Warsaw University of Technology）等机构的研究人员开展了一项重要研究，相关成果发表在《Communications Biology》上。这项研究聚焦于染色质构象捕获（Chromosome Conformation Capture，3C）技术中的 HiChIP（一种结合了染色质免疫沉淀的 Hi-C 实验改进方法），旨在优化实验方案，提高染色质环和条纹的检测效率，并开发更有效的生物信息分析流程。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，对细胞进行固定，采用甲醛（FA）单交联和 FA - 乙二醇双（琥珀酰亚胺琥珀酸酯）（EGS）双交联两种方式处理细胞；接着进行 HiChIP 实验，按照特定的实验步骤进行染色质免疫沉淀和文库制备；然后利用开发的 nf-HiChIP 等多种生物信息分析工具对 HiChIP 数据进行处理和分析；最后通过生物物理建模方法，如使用 LoopSage 进行环挤压建模。

下面来看看具体的研究结果：

• 标准 cohesin HiChIP 协议的局限性：研究人员发现，公开可用的 cohesin（SMC1）HiChIP 数据在 GM12878 淋巴母细胞系（LCL）中，与 CTCF HiChIP 数据相比，信噪比低很多。在其他细胞系，如 REC-1 和 HCC1599 中，也观察到类似的低信噪比情况。这表明标准的 cohesin HiChIP 协议在检测染色质相互作用时，存在一定的局限性。
• 双交联协议的优势：为了改善 cohesin HiChIP 实验的质量，研究人员测试了一种改良的 HiChIP 协议，即添加 EGS 的双交联协议（FA-EGS HiChIP 或 dcHiChIP）。实验结果显示，这种双交联协议提高了 cohesin ChIP 的效率，使得检测到的 cohesin HiChIP 峰值更可靠。通过多种分析方法，如基因组浏览器观察、Pearson 相关系数分析、峰值调用分析等，发现双交联 HiChIP 的信号质量更高，与 ChIP-seq 数据的相关性更强，并且能检测到更多的 cohesin 结合位点。
• 对染色质环检测的改进：研究人员使用了 nf-HiChIP、ChIA-PIPE 和 Juicer 等算法来检测染色质环。结果表明，双交联 HiChIP 样本中检测到的染色质相互作用更多，环的数量和强度都有显著提升。与其他 cohesin HiChIP 样本相比，dcHiChIP 样本中检测到的环数量至少是其两倍，且富集分数更高。这说明双交联 HiChIP 协议在检测 cohesin 介导的染色质环方面，具有明显的优势。
• 对建筑条纹检测的优化：研究人员利用 Stripenn 和 gStripe 两种工具对建筑条纹进行检测。结果发现，虽然 Stripenn 在 dcHiChIP 样本中检测到的条纹数量比标准 HiChIP 样本略少，但 gStripe 在 dcHiChIP 样本中检测到的条纹数量明显更多。而且，dcHiChIP 样本的条纹特征更清晰，包含更多的环，并且条纹之间的共定位现象更明显。这表明双交联 HiChIP 协议能够更详细地揭示建筑条纹的结构和特征。
• 构建准确的环挤压模型：研究人员利用改进的 cohesin HiChIP 数据和 LoopSage 方法，构建了环挤压的生物物理模型。通过模拟实验，发现模型能够较好地重建实验观察到的环和条纹模式，与实验数据的相关性较高。这为深入理解 cohesin 在染色质组织中的作用机制提供了有力的支持。

在研究结论和讨论部分，研究人员指出，双交联的 cohesin HiChIP 实验在人类淋巴母细胞中，显著提高了信噪比、ChIP 效率，增强了染色质环和条纹的检测能力。开发的 nf-HiChIP 管道，能够更高效地分析 HiChIP 数据，且无需额外的 ChIP-seq 实验。此外，结合实验数据和计算模型，进一步验证了关于 cohesin 扩散、结合和脱离 DNA 的假设，提升了对染色质组织生物物理机制的理解。

总的来说，这项研究为染色质空间组织的研究提供了更有效的实验方法和分析工具，有助于深入探究染色质结构与细胞核内各种生命活动之间的关系，为相关领域的研究开辟了新的道路，具有重要的理论和实践意义。