USP7 V517F 突变：解析 USP7 抑制剂耐药机制，开辟癌症治疗新方向

在癌症治疗中，USP7 作为有潜力的靶点，其抑制剂（USP7i）的耐药机制尚不明确。研究人员开展了关于 USP7i 耐药机制的研究，发现 USP7 基因 Exon 14 的 V517F 突变会导致耐药。这为患者筛选和新一代 USP7i 的开发提供了理论依据。

　　在癌症的复杂战场上，科学家们一直努力寻找有效的治疗靶点和药物，以攻克这一顽疾。去泛素化酶（DUBs）家族中的泛素特异性蛋白酶 7（USP7），因其在维持蛋白质稳态、调控关键细胞功能方面的重要作用，成为了癌症治疗的潜在希望之星。异常表达的 USP7 在恶性肿瘤中频繁出现，它能增强 E3 连接酶小鼠双微体 2（MDM2）的稳定性，促进 p53 的降解，扰乱 MDM2-p53 通路，进而推动肿瘤的发生发展。因此，USP7 成为了癌症治疗药物研发的关键靶点。

近年来，针对 USP7 的抑制剂（USP7i）研发取得了一定进展。多种 USP7i 在体外和动物异种移植模型中展现出抑制癌细胞生长的潜力，无论是 TP53 野生型还是突变型细胞，都能受到 USP7i 的抑制，且该抑制剂还能诱导多发性骨髓瘤（MM）细胞凋亡，并克服对硼替佐米的耐药性，同时使肿瘤对其他抑制剂更敏感。然而，如同其他抗癌药物一样，耐药性问题逐渐浮现，严重阻碍了 USP7i 的临床应用。目前，关于 USP7i 耐药机制的研究十分匮乏，这成为了癌症治疗领域亟待解决的问题。

为了深入探究这一关键问题，中国科学院上海药物研究所的研究人员展开了一项重要研究。他们旨在揭示 USP7i 的耐药机制，为后续的临床应用和药物研发提供有力支持。该研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员运用了多种关键技术方法。通过构建细胞模型，对 CHP-212 细胞进行处理获得 USP7i 耐药细胞系；采用全外显子测序（WES）技术检测相关基因的突变情况；利用等温滴定量热法（ITC）评估蛋白与药物的结合亲和力；借助 AlphaFold2 预测蛋白结构变化；运用 CRISPR/Cas9 技术构建基因编辑细胞系，以明确突变在耐药中的作用。

在研究结果部分：

1. 建立 USP7i 耐药细胞模型：研究人员发现，CHP-212 细胞对 USP7i 敏感，通过持续给予高浓度的 USP7-797 处理，成功获得了耐药细胞系 CHP-212-Rmix以及 6 个耐药单克隆亚系（R1 - 6）。这些耐药细胞对 USP7-797 和 FT671 的敏感性显著降低，对 GNE-6640 的耐药性仅有轻微增加，且对其他化疗药物仍保持敏感性。
2. 耐药细胞的细胞周期和凋亡变化：USP7 抑制原本会使 CHP-212 细胞出现大量凋亡并伴随 G1 期阻滞。但耐药细胞在无 USP7i 处理时就呈现 G1 期阻滞，且在接受 USP7-797 和 FT671 处理后，细胞周期分布变化不明显，凋亡也显著减少，相关凋亡蛋白的激活也降低，表明耐药细胞对细胞周期阻滞和凋亡诱导均产生了抵抗。
3. USP7 催化结构域的 V517F 突变导致耐药：对耐药克隆 R2 和 R3 进行全外显子测序，发现除了 USP7 基因 Exon 14 发生 c.G2170>T 的杂合突变，导致 V517F 突变外，其他相关基因未出现治疗诱导的突变。该突变未影响 USP7 的 mRNA 和蛋白水平，但降低了对 USP7 通路的抑制作用，使 V517F 突变体对 USP7-797 和 FT671 的敏感性大幅下降，而对 GNE-6640 的敏感性影响较小。
4. V517F 突变削弱化合物亲和力：ITC 实验表明，USP7_V517F 与 FT671 和 USP7-797 的结合亲和力分别下降了 67 倍和 57 倍。AlphaFold2 预测显示，V517F 突变使 Y514 残基侧链构象改变，指向抑制剂结合口袋，与抑制剂产生冲突，影响了抑制剂的结合。构建不同 517 位残基的突变体发现，V517Y 突变也会显著降低结合亲和力，而 V517G、V517A 和 V517I 突变则对结合亲和力影响较小。
5. 携带 V517F 突变的细胞对 USP7i 耐药：利用 CRISPR/Cas9 技术将 V517F 突变引入 CHP-212、LNCaP 和 Capan-1 细胞系中，构建了表达突变体的细胞系。这些细胞系对 USP7-797 和 FT671 的敏感性显著降低，且在接受 USP7i 处理后，p53、p21、c - caspase-3 和 cleave - PARP1 等蛋白水平下降，表明细胞对 USP7i 产生了耐药性，且该耐药性与 p53 状态无关。

在研究结论与讨论部分，该研究明确了人类肿瘤细胞系对 USP7-797 产生耐药的原因是 USP7 基因 Exon 14 的编码序列突变导致 V517F 突变。这一突变发生在化合物结合口袋内，引发局部空间位阻，显著降低了 USP7 与抑制剂的亲和力。通过构建 V517F 突变模型系统，进一步证实了该突变会导致对 USP7i 的耐药。这些结果为开发能够克服耐药机制的第二代 USP7i 提供了潜在策略。同时，研究还发现 V517F 突变可能是一个潜在的耐药热点，对其深入研究有助于未来在临床中预测患者接受 USP7i 治疗后的复发情况，从而指导更精准的治疗。这一研究成果为癌症治疗中克服 USP7i 耐药问题带来了新的希望和方向，对推动癌症治疗的发展具有重要意义。