# 综述：小分子抗生素发现的创新视角
在现代医学中，抗生素无疑是至关重要的存在，它帮助人类抵御了众多细菌感染性疾病。然而，如今多药耐药（MDR）细菌感染的出现，却让抗生素的疗效受到了严重威胁。细菌的耐药性不断进化，使得抗生素的使用寿命大幅缩短，这不仅限制了制药企业的投资回报，还导致新抗生素的审批速度放缓。为了应对这一严峻挑战，世界卫生组织（WHO）制定了四项关键的创新标准，旨在推动新型抗生素的研发，这些标准包括新的化学类别、新的作用靶点、新的作用模式（MoA）以及与现有抗生素无交叉耐药性。在这样的背景下，本文对小分子抗生素发现的创新方法进行了深入综述，为攻克耐药菌感染难题带来了新的希望。
一、抗菌化合物的发现途径
在寻找具有抗生素潜力的化合物时，主要有两种来源：天然产物和化学合成。针对这两种来源的化合物，常用的筛选方法有全细胞筛选和基于靶点的筛选。
全细胞筛选是一种经典的方法。从天然产物角度来看，土壤中的真菌和细菌是 “天然药库”，它们能产生各种化学物质。科学家们可以提取这些物质，通过全细胞筛选来检测其对细菌生长的抑制作用。历史上，基于 “Waksman Platform” 的全细胞筛选策略开启了抗生素发现的黄金时代，许多至今仍在使用的抗生素都是通过这种方式被发现的。对于化学合成的小分子库，全细胞筛选则是直接将合成的化合物作用于活细菌细胞，从中筛选出具有抗菌活性的物质。
基于靶点的筛选则是另一种重要策略。这种方法聚焦于确定抗生素作用的特定靶点，比如细菌的关键蛋白质或酶。许多抗生素发现项目采用这种方法，在体外筛选能够抑制纯化细菌靶点的化合物。不过，这种方法也存在局限性。在体外表现出活性的化合物，往往在进入完整细菌细胞时遇到阻碍，尤其是革兰氏阴性菌，其额外的外膜会阻挡化合物进入。而且，“Lipinski Rule of Five”（Ro5）这一用于筛选化合物溶解性和渗透性的规则，在预测化合物能否穿透革兰氏阴性菌细胞膜时也并不适用，许多抗生素，如四环素和利福平，都不符合 Ro5 规则，这凸显了抗菌剂与其他药物在性质上的差异。
无论是天然来源还是化学合成的化合物，在筛选过程中都面临着一些问题。高通量筛选（HTS）虽然能够测试大量化合物，但合成小分子抗生素的发现率通常低于 0.1%，天然抗生素分子的发现率同样很低，还经常出现重复发现或因性质不佳而被丢弃的情况。筛选出的活性化合物（命中化合物）后续还需经过一系列复杂的过程，如先导化合物的生成、优化以及临床前开发等，但这些步骤的淘汰率都很高，总体来看，小分子抗生素发现的成功率可能低至 10?? 。这表明，传统的筛选方法虽然在一定程度上取得过成功，但如今需要创新来解决有效抗生素供应不足的问题。
二、从过往经验中加速未来发展
WHO 提出的新靶点、新类别和新 MoA 这三个创新标准之间存在着紧密的联系，它们共同致力于降低交叉耐药的可能性，这也是 WHO 的第四个创新标准。一个全新的靶点，作用于病原体之前未被开发利用的生物学弱点，遇到现有耐药机制的可能性较低；新的化学类别拥有独特的分子结构，能够减少因针对其他抗生素类别产生的耐药机制而受到影响的几率；新的 MoA 则通过作用于不同的生化过程，进一步降低耐药途径重叠的风险。这三个因素相互协同，有助于实现与现有抗生素无交叉耐药性，从而确保对 MDR 病原体的有效性。在早期抗生素发现阶段，创新意味着采用原创的方法或解决方案，以满足对更多有效抗生素的迫切需求。
三、创新点 1：新型抗生素化学类别
新型抗生素化学类别的稀缺状况正随着化学空间的拓展而得到改善。所谓化学空间，是指所有可能的化合物领域。随着虚拟结构生成技术的进步、合成化学的发展以及对天然产物的不断探索，化学空间得到了极大的拓展。虽然在 HTS 中已经测试了数百万种化合物来寻找抗菌分子，但与目前可用于药物发现的化学空间相比，这些数量微不足道。据估计，可筛选的化合物数量约为 10?? ，如果能够全面筛选化学空间，有望发现更多的抗菌药物。
人工智能（AI）的发展为这一探索带来了新的契机。AI 中的机器学习能够利用以往 HTS 产生的数据来训练模型，从而预测虚拟小分子库中的抗菌活性。通过虚拟筛选，当对 AI 模型预测为有活性的化合物进行实验筛选时，命中率有望提高。深度学习作为机器学习的一个分支，在预测小分子生物活性方面表现出色。它可以通过神经网络对复杂的非结构化数据集进行建模，比如用简化分子输入线输入系统（SMILES）字符串或图卷积网络（GCNs）来描述小分子的化学结构，进而识别出与生物活性相关的特征。
一些研究团队已经利用 AI 取得了令人瞩目的成果。JJ Collins 实验室率先建立了基于 DMPNN 的深度学习模型来预测小分子的抗菌活性，并发现了 Halicin。Halicin 的化学结构与现有抗生素截然不同，对包括多药耐药的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌在内的多种病原体都具有活性，其独特的结构可能是避免现有耐药性的关键。Liu 等人也通过深度学习模型重新发现了 RS102895，即 abaucin，它对鲍曼不动杆菌具有窄谱抗菌作用。Rahman 等人利用深度学习模型对天然产物库进行筛选，发现了 PHAR261659 及其立体异构体 STL529920，即 PHAR (A)，它们属于新型细菌生长抑制剂。
不过，AI 模型也存在一些问题，比如神经网络的黑箱性质使得人们难以理解其预测的依据。可解释人工智能（xAI）的出现则有助于解决这一问题，它不仅能给出预测结果，还能解释背后的推理过程。像 MEGAN 这样的模型，可以帮助研究人员了解哪些化学性质或子结构在模型预测中最为重要，从而确定与生物活性相关的子结构。此外，生成模型如 SyntheMol 能够通过计算生成具有抗生素活性的新型可合成分子。Wong 等人利用这类模型发现了两种针对金黄色葡萄球菌的新型抗生素分子。
除了 AI 驱动的方法，探索微生物基因组和培养以前未培养的微生物也是发现新型抗生素化学类别的重要途径。Libis 等人通过捕获、优先表达生物合成基因簇，发现了 ECO-0501，它与 conkatamycin 相关。Ling 等人则从 10,000 种分离物的提取物中筛选出了 teixobactin，它是由 Eleftheria terrae 产生的代谢物，能抑制细胞壁合成，对革兰氏阳性菌具有强大的活性。这些例子都展示了基于新化学类别的抗生素发现新时代的广阔前景。
四、创新点 2：新靶点
拓展抗生素的作用靶点对于应对日益严峻的抗菌耐药性挑战至关重要。研究人员希望找到那些对细菌生存至关重要，但与人类细胞过程不同的靶点，这样开发出的抗生素即使面对 MDR 菌株也能保持有效性。然而，传统的基于靶点的抗生素发现方法存在缺陷，特别是在体外实验中找到的针对纯化靶点的活性化合物，在实际感染环境中可能无法有效穿透细菌复杂的细胞包膜或逃避外排泵的作用。
针对革兰氏阴性菌，其外膜是一道难以逾越的屏障，降低了许多分子的通透性并促进外排。为了克服这一障碍，研究人员开始关注外膜分子成分作为靶点。BamA 是革兰氏阴性菌 β - 桶组装机器（BAM）的重要组成部分，由于其在细胞表面的位置以及在革兰氏阴性菌中的保守性，成为了一个有潜力的抗菌靶点。已经有多种针对 BamA 的抑制剂被发现，比如 darobactin，它是由线虫的细菌共生体产生的天然肽。对 darobactin 和 BamA 相互作用的研究发现，darobactin 结合在 BamA 的侧向门，阻断了 BamA 与 β - 信号结合位点的相互作用。此外，Sun 等人通过筛选肽库，发现了 PTB1-1 和 PTB2 两种与 BamA 结合的肽，它们分别作用于 BamA 的不同状态，对大肠杆菌具有一定的抑制活性。不过，目前对于 BamA 与抑制性小分子结合的结构研究还需要进一步深入，以更好地验证这一靶点。
除了针对外膜靶点，通过化学遗传学方法也可以发现新的靶点。Johnson 等人在结核分枝杆菌（Mtb）中采用化学遗传学方法，发现了靶向外排泵 EfpA 的 BRD-8000，经过化学优化得到的 BRD-8000.3 对非复制、耐药的 Mtb 具有有效抑制作用，并且 BRD-9327 与 BRD-8000.3 具有协同作用，为结核病治疗提供了新的思路。Li 等人利用冷冻电镜（Cryo-EM）进一步研究了 Mtb 的 EfpA，为将其作为新的抗生素靶点提供了更多结构信息。但在开发针对 EfpA 的外排泵抑制剂时，需要注意潜在的脱靶效应。
在基因组层面，化学遗传学结合转录组学或基因敲低技术也能发现新靶点。PerSpecTM 通过比较抗生素处理前后铜绿假单胞菌细胞的转录谱，确定了三种抗铜绿假单胞菌化合物的靶点。Rahman 等人创建的 CIMPLE-seq 则用于表征 PHAR (A) 的作用机制，发现它能抑制肽基 - tRNA 水解酶（Pth），这是一种在蛋白质合成过程中对肽基 - tRNA 回收至关重要的细菌保守蛋白，不过还需要更多研究来验证 Pth 作为抗菌靶点的有效性。
在确定靶点时，不能仅仅依据分子成分在细菌中的必要性和保守性，还需要考虑其在人体中是否存在、代谢作用以及可成药性等因素。像 Target-Pathogen 这样的平台可以对靶点进行优先级排序，然后通过虚拟药物筛选，基于定量构效关系（SAR）来寻找可能与靶点结合的小分子。例如，Post 等人基于靶点设计提高了 Promysalin 针对铜绿假单胞菌琥珀酸脱氢酶（Sdh）的活性。此外，了解小分子穿透细菌细胞包膜的物理化学性质，如大小、极性、电荷和脂溶性等，对于设计能够有效作用于靶点的抗生素至关重要。通过将这些知识与针对靶点的 HTS 以及基于细胞包膜穿透规则的合理优化相结合，可以克服传统靶点发现方法的局限性，为发现有效的、能够穿透细胞的抗生素开辟道路。
五、创新点 3：新 MoA
引入具有新 MoA 的抗生素对于延长抗生素的有效性至关重要。新的 MoA 可以绕过现有的耐药机制，使细菌难以存活和繁殖，从而减缓耐药性的产生，延长新抗生素的使用寿命。
SCH-79797 是一个典型的例子，它是通过对具有受损外膜的大肠杆菌 lptD4213 突变体进行无偏全细胞筛选发现的。SCH-79797 是一种人类 PAR-1 拮抗剂，对多种临床重要的革兰氏阳性和革兰氏阴性病原体都具有强大的抗菌活性。深入研究发现，它通过双机制杀死细菌，其中吡咯并喹唑啉二胺部分作用于叶酸代谢，而异丙基苯部分则破坏细胞膜完整性。
zosurabalpin 也是一种具有新 MoA 的抗生素，它针对碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌，作用于之前 FDA 批准药物未作用过的靶点。zosurabalpin 通过抑制 LptB?FGC 蛋白复合物，阻断脂多糖（LPS）的运输，导致 LPS 在细胞内积累至毒性水平，最终使细菌死亡。
在肽聚糖合成和周转过程中，也发现了一些具有新 MoA 的化合物。corbomycin 是从链霉菌属中纯化得到的一种糖肽，它通过独特的系统发育引导方法发现其生物合成基因簇。corbomycin 对革兰氏阳性菌，包括耐甲氧西林和达托霉素的金黄色葡萄球菌具有良好的抑制活性。研究发现，它作用于肽聚糖代谢的下游转糖基化步骤，并且与其他细胞壁和膜活性化合物没有协同作用，其耐药性发展频率较低。
clovibactin 同样是通过创新的微生物培养方法发现的，它从 β - 变形杆菌 E. terrae 培养物中纯化得到，结构与 teixobactin 相似，对革兰氏阳性菌具有很强的杀菌活性，且自发耐药频率极低。研究表明，clovibactin 通过与含十一碳烯基焦磷酸的分子（如脂质 I 和脂质 II）或十一碳烯基焦磷酸结合，抑制细胞壁合成，并且它通过一种不寻常的疏水界面或 “笼状” 结合模式与靶点结合，使其对耐药性的发展具有很强的抵抗力。
当新型化学支架作用于新型靶点时，也会产生新的 MoA。Debio-1452-NH?是通过机器学习引导的方法从抗生素脱氧新霉素衍生而来的。脱氧新霉素通过抑制革兰氏阳性菌中的 DNA 促旋酶发挥抗菌作用，而 Debio-1452-NH?则靶向脂肪酸延长过程中的关键酶烯酰 - 酰基载体蛋白还原酶（FabI）。通过预测模型提高其通透性后，Debio-1452-NH?对多种革兰氏阴性病原体都具有强大的抗菌活性，并且能够有效拯救感染 ESKAPE 病原体的小鼠模型。
六、创新点 4：无交叉耐药性
为了避免对现有抗生素产生耐药性，人们可以对新抗生素进行合理的重新设计。新一代现有类别的抗生素能够满足克服临床耐药性的迫切需求。
cefiderocol 是头孢菌素的一种铁载体，它利用细菌的铁摄取系统进入细胞，绕过了常见的耐药机制，与其他 β - 内酰胺类抗生素的交叉耐药性较低。plazomicin 是一种新一代氨基糖苷类抗生素，由西索米星衍生而来，通过合成修饰使其与细菌核糖体的结合位点不同于旧的氨基糖苷类抗生素，从而能够绕过几乎所有临床相关的耐药机制，对包括肠杆菌科、铜绿假单胞菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在内的耐药菌都具有有效性。然而，尽管 ceferiderocol 和 plazomicin 获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准用于治疗复杂尿路感染，但开发 plazomicin 的公司 Achaeogen 却破产了，这凸显了当前抗菌药物开发中的矛盾，即抗生素为了防止新耐药性的产生而被保留用于最严重的病例，导致其市场盈利性较低。
降低新耐药机制快速产生的可能性与避免与现有抗生素的交叉耐药性同样重要。可以通过寻找具有多种作用、靶向多个分子元件的化合物，或者将具有相加或协同机制的单靶点抗生素组合使用来实现这一目标。虽然本文未详细探讨，但多药理学方法在抗生素发现中具有广阔的前景。
七、早期发现之外的挑战与应对
早期抗生素发现的创新方法为扩大有前景的候选抗生素库提供了可能，为药物开发创造了新的机遇。然而，从实验室到临床研究、监管审批以及商业化的道路上，仍然充满了诸多挑战。
开发新抗生素是一项成本高昂的工作，研发成本通常超过 10 亿美元。与治疗慢性疾病的药物不同，抗生素通常用于短期治疗，盈利性较低，这使得许多制药公司将重点转向更有利可图的治疗领域，如肿瘤学，导致新抗生素开发减少。2010 年至 2014 年，FDA 仅批准了 6 种新抗生素，与 1980 年至 1984 年的 19 种批准形成鲜明对比。到 2019 年底，活性研究性新药（IND）申请数量降至 11 年来的最低水平，2010 年至 2019 年启动的抗菌 IND 数量是过去三十年中最少的，这进一步加剧了全球抗菌耐药性（AMR）危机。
为了应对这些挑战，人们采取了多种措施。立法措施如《立即产生抗生素激励法案》（GAIN Act）试图通过延长市场独占期、加快 FDA 审批和免除费用等方式来激励抗生素开发，但这些措施在产生新型抗生素类别方面效果有限。《21 世纪治愈法案》引入了有限人群抗菌药物（LPAD）途径，旨在简化针对小而高风险人群的抗生素审批，虽然降低了临床试验成本，但适用范围较窄，且小型试验在识别疗效和安全性问题方面的统计效力较低。
各国也在尝试创新的全球解决方案。英国率先实施了完全脱钩的拉动激励措施，通过试点订阅模式，每年向制药公司支付固定费用以获取两种抗生素的使用权，这种模式保证了开发者的稳定收入流，有望使抗生素研发更具吸引力，但长期影响仍有待评估。自 2022 年以来，G7 国家，包括日本、加拿大、英国、欧盟和美国等，都在实施各种策略来对抗 AMR。美国的《先锋抗菌药物订阅以终结耐药性激增法案》（PASTEUR Act）提出政府与制药公司签订订阅式合同，使抗生素开发在财务上更具可行性，但该法案同样没有解决抗生素发现中的科学挑战。
除了财务挑战，抗生素发现还面临着科学难题。过去二十年，AMR 领域由于经验丰富的科学家退休且缺乏后续人才补充，出现了严重的人才流失，导致知识差距不断扩大，年轻科学家因缺乏激励而不愿进入传染病研究领域。为了解决这一问题，需要持续投资于教育和培训，以重振该领域。同时，还需要加大对早期研究的投资，促进学术界和产业界的合作，并支持专注于新型抗生素的研究计划。非营利组织如皮尤慈善信托基金的 SPARK（抗生素研究与知识共享平台）致力于搭建学术界和产业界之间的桥梁，而跨大西洋抗菌耐药性特别工作组（TATFAR）等合作框架则简化了临床试验的监管要求。然而，各国在资金投入和研究重点上的差异仍然<>
八、结论
在 WHO 创新标准的指引下，预测生物学的最新进展正在重塑早期抗生素发现领域。这些进展将 HTS 的广泛探索潜力与基于结构的药物设计的精确性和特异性相结合，有望提高有前景化合物的识别效率，并简化其优化过程，缩小大规模发现与靶向创新之间的差距。全球对抗抗菌耐药性的努力、早期抗生素发现的创新以及在解决监管和商业化问题上的合作必须持续推进，以应对 MDR 病原体日益增长的威胁，确保抗生素在现代医学中的重要地位。
未来，随着科技的不断进步，相信会有更多创新的方法和策略涌现，为解决抗生素耐药性问题带来新的曙光，让抗生素这一医学瑰宝在未来继续发挥其重要作用，守护人类的健康。
