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来自中国的研究人员为提升传统量子点荧光免疫分析（QD-FLISA）灵敏度，设计 DNA 纳米线介导的方法，显著提高检测性能，对疾病早筛意义重大。
在生物研究和医学诊断领域，对低浓度蛋白质生物标志物进行高灵敏度分析至关重要。酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种强大的分析技术，凭借其特异性的抗原 - 抗体识别特性，已成为临床诊断和实验室的重要方法。目前，人们探索了多种 ELISA 技术，利用不同的信号转导原理，其中荧光法以其高灵敏度、操作简便和响应迅速的特点，在信号输出方面颇具吸引力。荧光量子点（QDs）因具有可调节波长、宽激发光谱、高荧光亮度和良好的光稳定性等优异光学特性，成为免疫分析中理想的信号标签。常见的量子点荧光免疫分析（QD-FLISA）通常用 QDs 替代酶作为信号标签，通过特异性的抗原 - 抗体结合实现对目标分子的定量检测，具备高灵敏度、准确性和高通量检测的优势，在临床应用中潜力巨大。然而，即便 QDs 的量子产率（QY）高达 1，由于单个 QD 标记在一个分析物上，其光致发光（PL）强度本质上是有限的。虽然合成具有大表面积并负载更多 QDs 的 QD 微球是克服这一限制的有效策略，但该方法需要根据 QDs 表面不同的配体进行定制，难以普遍推广。此外，大量研究聚焦于 QD 微球 PL 信号的变化，却缺乏对负载 QDs 数量的控制。因此，开发构建具有高且可控信号的高灵敏度 QD-FLISA 的新策略迫在眉睫。
鉴于 DNA 独特的自我识别特性、生物相容性和多样的修饰能力，其在生物分析的信号放大中得到广泛应用。特别是无酶 DNA 扩增技术，因其比依赖酶的扩增表现更优而备受关注。杂交链式反应（HCR）作为一种等温无酶扩增方法，可通过两种稳定发夹结构在引发剂存在下的自组装来延伸 DNA 链组件，每个引发剂拷贝都能诱导一次 HCR 事件，连接多个寡核苷酸，在无需酶参与的情况下实现目标检测的信号放大。目前，HCR 因其出色的放大能力和简单设计，已广泛应用于基于 QD 的生物传感，但基于 HCR 的扩增技术在 QD-FLISA 中的应用却鲜有报道。
在此，研究人员提出了一种超灵敏的 DNA 纳米线介导的量子点荧光免疫分析技术（DNA-nano-QD-FLISA）用于蛋白质检测，其中 DNA 纳米线是通过 HCR 组装而成的具有多个重复单元的长双链 DNA。以与癌症、心血管和神经系统疾病相关的临床生物标志物 C 反应蛋白（CRP）作为目标分析物。在目标蛋白的作用下，会形成包含一抗、二抗和目标蛋白的三明治复合物，从而触发具有多个结合位点的生物素化 DNA 纳米线（bio-DNA 纳米线）与 DNA 功能化量子点（DNA-QDs）的结合，进而观察到来自 QDs 的放大 PL 信号。与传统的 QD-FLISA 相比，引入 DNA 纳米线后获得了增强的 PL 信号，可将 CRP 的检测限（LOD）大幅降低近 16 倍。同时，该方法成功应用于检测其他低丰度蛋白质，通过使用多色 QDs 展示了其对多种目标分析物进行同时分析的能力。最重要的是，研究发现该设计方法的检测性能与 DNA 纳米线的长度密切相关，这为调整检测范围提供了一种简单直接的方法。
研究人员对实验所需的试剂、主要仪器和 DNA 序列等详细信息进行了记录（见补充信息），并在补充信息中给出了疏水性 CdSe/ZnS 量子点、3 - 巯基丙酸修饰的量子点（QD@MPA）、二氧化硅包裹的量子点（QD@SiO2）、HS - DNA 功能化的 QD@MPA（DNA-QD@MPA）、NH2-DNA 功能化的 QD@SiO2（DNA-QD@SiO2）、NH2-DNA 功能化的 QD@MPA（DNA-QD@MPA-2）以及生物素标记的抗 CRP 二抗等的详细制备过程。
DNA-nano-QD-FLISA 检测蛋白质的原理如下：为形成 DNA 纳米线，研究人员合理设计了在 3' 端标记生物素（bio-primer）的引物链以及两种动力学稳定的亚稳 DNA 发夹结构（分别命名为 H1 和 H2），其中 H2 在 5' 端含有用于结合 DNA-QDs 的连接链。将它们混合在一起时，bio-primer 会触发 H1 和 H2 的自组装，从而生成 DNA 纳米线。
总之，研究人员通过引入由 HCR 组装的 DNA 纳米线，开发出一种用于蛋白质检测的超灵敏 QD-FLISA。与传统 QD-FLISA 相比，DNA 纳米线的使用可促使多种 QDs 在微孔板上积累。此外，每个目标 CRP 有望触发多个 DNA 纳米线的附着，比 QD-FLISA 提供更高的 PL 信号放大。在信号放大性能方面，所提出的 DNA-nano-QD-FLISA 表现出色。该研究得到了中国国家自然科学基金（No. 51972098，No. 21905074）、河南省青年骨干教师基金（No. 2021GGJS123）、河南省教育厅基金（24A150027）以及南阳师范学院国家自然科学基金培育基金（No. 2022PY007）的支持。
