活细胞中蛋白质赖氨酸甲基丙烯酰化（Kmea）的遗传编码研究及重大发现

赖氨酸酰化在细胞过程中意义重大，但赖氨酸甲基丙烯酰化（Kmea）研究受限。研究人员开展将非天然氨基酸 ε-N - 甲基丙烯酰赖氨酸（MeaK）导入蛋白质的研究，发现 CypA 的 Kmea 修饰位点，明确其功能及调控机制等，为相关疾病研究提供新思路。

　　在生命的微观世界里，蛋白质的修饰如同精密的调控开关，掌控着细胞的各种活动。赖氨酸酰化作为一种普遍存在的翻译后修饰（PTM），在转录、代谢、蛋白质定位和折叠等众多细胞过程中发挥着关键作用。随着研究技术的不断进步，科学家们借助抗体富集策略、高灵敏度质谱（MS）分析和生物信息学，已经识别出数千个赖氨酸酰化位点。然而，赖氨酸甲基丙烯酰化（Kmea）的研究却面临诸多挑战。目前仅在组蛋白中鉴定出 27 个 Kmea 位点，而且由于它与结构异构体赖氨酸巴豆酰化（Kcr）极为相似，使用常规生化方法很难将它们分离、纯化和区分，这极大地阻碍了对 Kmea 功能的深入探究。同时，现有研究 Kcr 或 Kmea 功能的方法存在局限性，如赖氨酸到谷氨酰胺的替代策略不适用于研究这两种修饰，细胞内过表达酰基转移酶或体外孵育的方法位点特异性和选择性有限，且难以通过色谱法或质谱区分修饰后的蛋白质。为了突破这些困境，深入了解 Kmea 的奥秘，浙江大学医学院附属第二医院、浙江大学癌症中心等机构的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们致力于开发一种通用的遗传密码扩展方法，将非天然氨基酸 ε-N - 甲基丙烯酰赖氨酸（MeaK）引入目标蛋白质，以探究 Kmea 在蛋白质中的功能。这项研究成果发表在《Nature Communications》上，为该领域的发展带来了新的曙光。

研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。首先是遗传密码扩展技术，通过对野生型 Methanosarcina barkeri 吡咯赖氨酰 - tRNA 合成酶（MbPylRS）的氨基酸结合口袋进行工程改造，获得了能识别 MeaK 的合成酶，实现了在大肠杆菌和哺乳动物细胞中特异性地将 MeaK 编码到蛋白质中。其次，利用亲和纯化质谱（AP-MS）技术，鉴定与甲基丙烯酰化 CypA 相互作用的蛋白质，分析 Kmea 对蛋白质相互作用组的影响。此外，还运用了蛋白质免疫印迹（Western blot）、流式细胞术、微尺度热泳（MST）等技术，从不同角度验证实验结果 ，深入探究 Kmea 修饰的功能和调控机制。

研究结果如下：

1. 非组蛋白蛋白质 CypA 中 Kmea 的鉴定：研究人员在研究硫氧还蛋白（Thioredoxin）与其他蛋白质的相互作用时，发现了硫氧还蛋白 1（TXN1）与环孢菌素 A（Cyclophilin A，CypA）之间存在直接相互作用。通过对 CypA 的 AP-MS 数据进行分析，发现 CypA 的 K125 和 K131 位点存在赖氨酸修饰，经鉴定为 Kmea。这是首次在非组蛋白蛋白质上发现 Kmea 修饰，此前仅在组蛋白中发现过该修饰。
2. 在大肠杆菌和哺乳动物细胞中对 Kmea 进行遗传编码：研究人员对 MbPylRS 进行改造，构建了多个突变体，筛选出 MbPylRS (Y349F)/MbtRNA^pylCUA 这一突变对，其在大肠杆菌中对 MeaK 的掺入效率和保真度较高，成功将 MeaK 掺入模型蛋白 MBP-Z 中。在哺乳动物细胞中，对 chPylRS 进行改造获得 MeaKRS6 - 8 突变体，筛选出 chPylRS Y384F/MmtRNA^pylCUA 这一组合，能高效将 MeaK 掺入 EGFP、CypA 和组蛋白 H3 等蛋白质中，证明了该方法在哺乳动物细胞中的可行性。
3. 比较野生型 CypA、CypA 突变体、CrK 掺入的 CypA 和 MeaK 掺入的 CypA 的相互作用蛋白：构建野生型 CypA、CypA K125A 和 CypA K125MeaK 等多种构建体，转染 HEK293T 细胞后进行 AP-MS 分析。结果显示，与野生型 CypA 相比，MeaK 掺入后 CypA 与 68 种蛋白质的相互作用增强，且有 10 种结合蛋白仅在 CypA K125MeaK 样本中被鉴定到。生物过程分析表明，这些蛋白质部分具有蛋白质二硫键还原酶活性或参与细胞氧化还原稳态。同时，比较 Kmea 和 Kcr 对 CypA 相互作用组的影响，发现 Kmea 在 CypA125 位点的存在可能影响细胞分化，并增强与 cGAS/STING 和 PI3K/AKT 信号通路相关的作用。
4. K125 位点的甲基丙烯酰化抑制了 CypA 的抗氧化能力：已知 CypA 与多种氧化还原酶相互作用，在细胞抗氧化过程中发挥重要作用。研究人员在 HeLa 细胞中掺入 MeaK 到 CypA 的 K125 位点，通过流式细胞术检测 ROS 水平。结果显示，与野生型对照细胞相比，表达 CypA 125MeaK 的细胞 ROS 水平显著升高，表明 Kmea 修饰可能干扰了 CypA 抑制 ROS 的能力。此外，K125 位点的甲基丙烯酰化还降低了 CypA 与 CsA 的结合亲和力。
5. CypA Kmea 受 HDAC1 调控：开发一种荧光探针 EGFP K85MeaK，验证了遗传编码的 Kmea 能被内源性脱乙酰酶识别。通过 AP-MS 实验和 Co-IP 实验，发现 HDAC1 - 3 与 CypA K125MeaK 相互作用，进一步研究表明 HDAC1 可降低 CypA 上 Kmea 的修饰水平，是 CypA Kmea 的潜在调节因子。
6. 遗传编码的 Kmea 发生甲基化：研究人员在分析 CypA K125MeaK 和 CypA K131MeaK 的 IP 样本 MS 数据时，发现含有 K125MeaK 和 K131MeaK 的胰蛋白酶肽段存在质量位移，证实遗传编码的 Kmea 在活细胞中可进一步甲基化为 ε-N - 甲基 -ε-N - 甲基丙烯酰化（Kmemea），并提出了可能的裂解途径。

研究结论和讨论部分指出，该研究成功开发了一种在活细胞中位点特异性地将赖氨酸甲基丙烯酰化（Kmea）引入蛋白质的策略，鉴定了甲基丙烯酰化 CypA 的相互作用蛋白，揭示了 Kmea 对 CypA 功能的影响以及其调控机制，发现遗传编码的 Kmea 可进一步甲基化。这一研究成果为深入理解 Kmea 修饰在细胞过程中的作用提供了重要依据，有助于探索与 Leigh 综合征等相关疾病的发病机制，为开发潜在的治疗策略奠定了基础。同时，研究也提出了一些有待解决的问题，如线粒体中甲基丙烯酰化和去甲基丙烯酰化的具体酶和机制尚不明确，内源性 Kmemea 的全面鉴定还需要更有效的工具和方法。未来的研究可以围绕这些问题展开，进一步拓展对蛋白质修饰领域的认知，为生命科学和健康医学的发展做出更大贡献。