小鼠睾丸O-糖基化图谱的全局解析：揭示精子发生过程中的动态修饰规律与不育症治疗新靶点

本期推荐：上海交通大学团队通过VVA/PNA lectin富集结合HCD-pd-EThcD质谱技术，首次绘制小鼠睾丸发育过程中349个O-糖蛋白的799个明确糖基化位点图谱，发现从圆形精母细胞到成熟精子阶段Tn抗原增加而T抗原减少的动态规律，证实GALNT3介导的O-糖基化通过稳定顶体蛋白（如ACRBP-proACR相互作用）调控精子形成，为男性不育诊断提供新分子标记。

　　

在生命孕育的奥秘中，精子发生犹如一场精密的分子交响乐，而蛋白质翻译后修饰则是其中至关重要的音符。近年来，科学家们逐渐认识到O-连接N-乙酰半乳糖胺（O-GalNAc）糖基化在生殖系统中的特殊地位——这种发生在丝氨酸/苏氨酸残基上的修饰，不仅占睾丸组织糖基化修饰的最高比例，更与顶体形成、精子成熟等关键过程密切相关。然而，由于缺乏系统性的糖蛋白组学分析，科学界对睾丸O-糖基化的时空动态规律及其功能机制仍知之甚少，这严重制约了男性不育相关诊疗靶点的开发。

上海交通大学的研究团队在《Nature Communications》发表的重要研究，通过多组学技术首次绘制了小鼠睾丸发育过程中的O-糖基化全景图谱。研究人员选取24日龄（以圆形精子细胞为主）和12周龄（以长形精子细胞为主）的小鼠睾丸组织，采用Vicia villosa凝集素（VVA）和花生凝集素（PNA）分别富集Tn（GalNAc-α1-Ser/Thr）和T（Galβ1,3GalNAc-α1-Ser/Thr）抗原修饰的肽段，结合高能碰撞解离-电子转移解离串联质谱（HCD-pd-EThcD）技术，实现了糖基化位点的精准解析。此外，研究还整合了流式分选、免疫共沉淀、体外糖基转移酶活性测定等功能验证实验。

研究结果部分，作者通过"O-glycans are located in round and elongated spermatids"章节揭示：凝集素染色显示O-糖基化信号仅出现在出生后24天以上的睾丸组织中，且Tn抗原在长形精子细胞中显著富集，而T抗原在圆形精子细胞中占优势。在"Global characterization of O-glycoproteome in mouse testes"部分，质谱数据鉴定出349个O-糖蛋白（含185个新发现成员），其中ACRBP、SPESP1等顶体相关蛋白呈现高度糖基化特征。"Distribution characteristics of O-glycosites in mouse testes"分析发现79%的差异糖肽变化源于糖基化修饰而非蛋白表达量改变，且O-糖基化位点偏好分布于蛋白质结构域边缘（19.4%）和无序区域（37.5%）。特别值得注意的是，在"Differential O-glycopeptides involve in spermatogenesis and fertilization"部分，研究人员发现蛋白酶S1结构域N端存在糖基化热点区域，提示O-糖基化可能调控精子发生过程中的蛋白水解加工。

功能验证章节"O-glycosylation Affects Interaction between pro-ACR and ACRBP"通过CHO-ldID糖基化缺陷细胞模型证实：GALNT3催化的O-糖基化能增强顶体蛋白ACRBP与前体蛋白pro-ACR的相互作用。后续实验还发现O-糖基化通过多种机制影响生殖蛋白功能：维持SPACA7稳定性、促进INSL6前体剪切、调控EQTN-SNAP25复合物形成以及SPESP1二聚化（见"O-glycosylation functions on SPACA7, INSL6, EQTN, and SPESP1"部分）。

这项研究在讨论部分强调了三方面突破性发现：一是建立了迄今最完整的睾丸O-糖蛋白数据库，其中210个为睾丸特异性表达；二是揭示了从圆形到长形精子细胞转变过程中Tn/T抗原比例的动态变化规律，这种变化与GALNT3/C1GALT1C1表达调控相关；三是通过多蛋白功能实验，系统阐释了O-糖基化通过稳定蛋白结构、调控酶切加工和介导分子互作等机制影响精子发生的分子原理。这些发现不仅为理解男性不育的分子机制提供了新视角，更为开发以特定糖基化修饰为靶点的诊断标志物和治疗策略奠定了理论基础。未来研究可进一步聚焦人类精子发生过程中保守的O-糖基化调控网络，以及特定糖基转移酶（如GALNT3/GALNTL5）作为不育症治疗靶标的转化潜力。