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本文综述了感染双链 RNA 病毒的利什曼原虫、阴道毛滴虫和蓝氏贾第鞭毛虫的研究，探讨其在宿主 - 寄生虫互作中的作用。
1. 引言
主要人类原生动物寄生虫病（PPDs）流行广泛，每年约有 7.9 亿病例，81 万人死亡，8240 万伤残调整生命年（DALYs）。这些疾病在免疫功能低下人群中更为严重，且目前缺乏有效无害的治疗策略。本文聚焦于利什曼原虫、阴道毛滴虫和蓝氏贾第鞭毛虫引起的重要疾病。
细胞外囊泡 / 外泌体（EVs/exos）信号传导是病毒 - 宿主相互作用网络研究的新兴领域。EVs 是含有多种核酸和蛋白质的脂质双分子层膜，在细胞间通讯、生理和病理过程以及免疫调节中发挥重要作用。寄生虫来源的 EVs 可调节宿主免疫反应，帮助寄生虫在宿主体内存活。
原生动物病毒是专性寄生于原生动物的病毒，多为球形或二十面体，直径 30 - 40nm，基因组 5 - 7kb，通常为非包膜双链（ds）RNA 病毒。利什曼原虫、阴道毛滴虫和蓝氏贾第鞭毛虫可分别被利什曼病毒（LRV）、阴道毛滴虫病毒（TVV）和贾第虫病毒（GLV）感染，这些病毒影响寄生虫的毒力和致病性，还可能为对抗寄生虫病提供创新策略。
宿主 - 病原体相互作用复杂，病毒与原生动物的共生关系中有多种分子机制来对抗宿主免疫激活。EVs 可包裹多种病毒，病毒也可调节 EVs 的产生和功能，二者在宿主免疫反应调节中发挥重要作用。本文将探讨原生动物内共生 dsRNA 病毒和 EVs/exos 的特征，及其在调节宿主免疫反应中的作用，以及寄生虫分泌的 EVs/exos 递送的原生动物内共生 dsRNA 病毒在疾病发病机制中的潜在作用。
2. 利什曼原虫
2.1. 利什曼病毒的流行病学
利什曼原虫是一种致命的原生动物寄生虫，可引起由白蛉传播的利什曼病，属于被忽视的热带病（NTDs）。全球每年新增 70 - 100 万病例，目前治疗依赖有副作用的药物。利什曼病有内脏型、皮肤型和黏膜皮肤型三种主要临床表现，与利什曼原虫的种类密切相关。
利什曼 RNA 病毒（LRV）存在于四个利什曼原虫亚属中的三个，其存在与寄生虫更高的致病性相关，有助于寄生虫生存和增强毒力，可能与利什曼原虫的进化适应性提高有关。目前已鉴定出四种 LRV，不同利什曼原虫对不同 LRV 的感染率不同。例如，南美亚马逊利什曼原虫（L. guyanensis）易失去 LRV 1，而旧大陆硕大利什曼原虫（L. major）对 LRV 2 的清除具有抗性。临床分离株中，L. (Viannia) guyanensis 和 L. (Viannia) braziliensis 的 LRV 感染阳性率约为 20 - 58%，74% 的利什曼原虫感染 LRV1，且 LRV1 通常在新大陆 Viannia 亚属物种分离株中被发现。此外，LRV1 与治疗抗性和黏膜皮肤疾病的发展有关，还可能加速部分皮肤型利什曼病向内脏型或黏膜皮肤型的进展。然而，也有研究表明 LRV1 在 L. (Viannia) panamensis 中的存在与临床病理增加无关。LRV2 存在于旧大陆利什曼原虫亚属中，其与症状严重程度和传播的相关性证据较少，仅发现一些毒力因子的 RNA 表达增加。除 LRV1 和 LRV2 外，在 L. martiniquensis 中还发现了 Leishbunyavirus 1（LmarLBV1）和有争议的来自 L. gymnodactyli 的 Narnavirus。
2.2. 利什曼原虫 EVs/exos 在寄生虫 - 宿主通讯中的作用
利什曼原虫 EVs/exos 由保守的内体分选转运复合体（ESCRT）途径产生。内吞作用可触发早期内体形成，进而发展为晚期内体，再形成多泡体（MVBs）。MVBs 可形成溶酶体或与细胞膜融合释放腔内囊泡，即 EVs/exos。此外，利什曼原虫还可从鞭毛袋分泌 EVs/exos。利什曼原虫 EVs/exos 是寄生虫感染和疾病进展的初始驱动因素，可在感染部位快速传播，为寄生虫入侵和寄生创造有利环境。
2.2.1. 利什曼原虫的内容物通过 EVs/exos 传递
利什曼原虫 EVs/exos 富含寄生虫的核酸和蛋白质等成分，可协助这些成分水平转移到宿主细胞。研究发现，利什曼原虫 EVs/exos 含有多种蛋白质，部分蛋白质具有免疫调节作用。例如，利什曼亚马逊原虫（L. amazonensis）EVs 可诱导中性粒细胞形成中性粒细胞胞外陷阱（NETs），NETs 可捕获 EVs 并杀死前鞭毛体。此外，EVs 还可加速利什曼原虫耐药基因的传播，如主要表面蛋白酶（MSP）可使免疫因子失活，有助于利什曼原虫逃避宿主的杀菌机制；糖蛋白 63（GP63）可影响巨噬细胞信号通路和宿主炎症反应，促进感染。
2.2.2. LRV1 利用外泌体途径传播
LRV1 被认为对人类无感染性，但可调节哺乳动物寄生虫病的严重程度。它可在寄生虫增殖时垂直传播，也可通过感染 LRV1 的寄生虫分泌的外泌体水平传播。研究表明，利什曼原虫外泌体可作为 LRV 病毒粒子的包膜，促进 LRV 在利什曼原虫中的传播，增强其感染性。感染 LRV1 的寄生虫分泌的 EVs 可增强炎症小体抑制作用，改变寄生虫和外泌体的组成，影响寄生虫 mRNA 基因的翻译效率。这些发现表明利什曼原虫外泌体在寄生虫 - 寄生虫和寄生虫 - 宿主相互作用的通讯和免疫调节中起重要作用。
2.3. LRV 感染的利什曼原虫对宿主免疫反应的调节
在利什曼原虫感染早期， toll 样受体（TLRs）介导的先天免疫激活缺失会延迟经典巨噬细胞的激活，有助于感染的建立，使宿主持续感染。感染后期，寄生虫介导 NOD 样受体（NLR）、炎症小体激活和炎症细胞因子分泌，导致炎症和皮肤病变恶化。
LRV1 有助于利什曼原虫耐受宿主免疫反应，促进感染和利什曼病的进展。转录组分析发现，LRV 感染的寄生虫可诱导细胞中多种基因的过表达，但细胞因子水平无显著差异。然而，也有研究表明 LRV1 感染依赖巨噬细胞产生的 I 型干扰素（IFNs）和体内信号传导来加重利什曼病。LRV 可触发 TLR3 和 TRIF 诱导 I 型 IFN 产生，进而诱导自噬，导致 ATG5 介导的 NLRP3 和 ASC 降解，限制 NLRP3 炎症小体的激活。此外，LRV 感染还可通过多种途径促进促炎介质的分泌，如 TLR3 - TRIF 和 TLR7 - MyD88 依赖的途径。同时，LRV 感染还可干扰 caspase - 11 的激活，抑制 IL - 1β 的释放。总体而言，LRV 感染的利什曼原虫抑制 NLRP3 炎症小体激活，加剧皮肤病变的发展，可能有助于寄生虫在患者体内形成长期慢性疾病。目前对 LRV1 的研究较多，但 LRV2 和 LmarLBV1 介导的宿主免疫调节机制仍有待进一步研究。
3. 阴道毛滴虫
3.1. 阴道毛滴虫病毒
阴道毛滴虫（T. vaginalis）是最常见的性传播病原体之一，2020 年全球 15 - 49 岁男女中约有 1.56 亿新发病例。其感染通常无症状，但可导致多种临床病理，如阴道炎、尿道炎、前列腺炎、早产和不孕，还会增加泌尿生殖道癌症、不良妊娠结局和其他性传播感染（如 HPV 和 HIV 感染）的风险。
阴道毛滴虫病毒（TVV）是首个被鉴定的 Totiviridae 科原生动物病毒，可在细胞分裂和交配时传播。临床分离的阴道毛滴虫通常感染一种或多种 TVV，不同国家的分离株感染率不同，据荟萃分析，TVV 在阴道毛滴虫中的估计感染率为 47%。目前已发现五种 TVV（TVV1、TVV2、TVV3、TVV4 和 TVV5），但它们的共感染对阴道毛滴虫毒力的影响尚不清楚。虽然有研究表明症状较轻患者分离的寄生虫仅感染 TVV1，而症状较重患者分离的寄生虫含有 TVV2，但不同 TVV 感染对阴道毛滴虫致病性的影响仍不明确，对 TVV3、TVV4 和 TVV5 的研究目前主要限于流行病学鉴定。
3.2. T. vaginalis EVs 与宿主细胞的相互作用
阴道毛滴虫 EVs/exos 是首个被报道可改变宿主细胞物理和生化特性的寄生虫细胞外囊泡。四跨膜蛋白（TSPs）是小分泌型 EVs/exos 的标志物，阴道毛滴虫外泌体含有 TSPs，且 TSPs 在细胞生物学和生理学的多个方面发挥重要作用。此外，阴道毛滴虫外泌体还含有 ESCRT 机制组件 VPS32 蛋白，可促进寄生虫附着于前列腺细胞，有助于其致病。阴道毛滴虫分泌两种类型的 EVs：由内体多泡体形成的小囊泡（50 - 150nm，外泌体）和从质膜出芽的较大囊泡（>200nm）。蛋白质组分析发现，阴道毛滴虫 EVs 中的许多蛋白质缺乏常规的 N 端信号肽或跨膜结构域，不同毒力表型的菌株分泌的 EVs 蛋白质成分不同，且阴道毛滴虫 EVs 在物理特征和蛋白质组成上与哺乳动物外泌体相似，这有助于对滴虫病的检测、诊断和治疗药物的定位。
3.2.2. T. vaginalis EVs 对受体宿主的影响
寄生虫分泌外泌体调节宿主免疫反应是近年来的研究热点。阴道毛滴虫 EVs 可促进寄生虫与宿主细胞的通讯，融合并将内容物分布到宿主细胞，增强寄生虫对细胞的粘附，控制细胞免疫反应。其内化是一个不依赖网格蛋白、由脂筏介导的内吞过程，吸收依赖于宿主细胞胆固醇和小窝蛋白 - 1。阴道毛滴虫 EVs 具有复杂的免疫调节功能，可通过减少宿主炎症反应帮助寄生虫持续存在，调节寄生虫诱导的细胞因子谱。例如，它可诱导阴道上皮细胞产生 IL - 6 反应，减少 IL - 8 反应；在 RAW264.7 细胞中增加 IL - 10、IL - 6 和 TNF - α 的产生；在体内抑制寄生虫感染小鼠的炎症反应，增加 IL - 10，减少 IL - 6、IL - 13 和 IL - 17。此外，阴道毛滴虫 EVs 还可作为寄生虫间通讯的介质，促进寄生虫的聚集和对宿主细胞的粘附。
3.3. 包装在 T. vaginalis EVs 中的 TVV 参与宿主 - 寄生虫和寄生虫 - 寄生虫通讯
TVV 感染可调节阴道毛滴虫的生物学特性，如参与调节 P270 mRNA 积累，导致不同蛋白质表达，改变寄生虫的致病性，影响宿主的促炎反应和对甲硝唑的敏感性。例如，TVV 可促进阴道毛滴虫对阴道上皮细胞的细胞粘附，调节半胱氨酸蛋白酶等毒力因子的表达，从而调节寄生虫在人类生殖黏膜的致病性。但也有报道称临床症状和甲硝唑耐药性与 TVV 感染无关。
3.3.2. TVV 对宿主免疫反应的调节
TVV 阳性的阴道毛滴虫分离株比无病毒的寄生虫诱导更多的 I 型干扰素，纯化的 TVV 病毒粒子可引发 TLR3 和 TRIF 依赖的炎症反应。研究发现，TVV 的 dsRNA 可被宿主细胞中的 TLR3 识别，从而放大阴道毛滴虫诱导的宿主促炎反应。TVV 可导致 NF - κB 激活，IL - 8、IFNα 和其他细胞因子的产生增加。关于 TVV 如何引发不同免疫反应，有两种推测：一是 TVV 衣壳的结构可能有助于释放病毒 dsRNA 被宿主细胞摄取；二是细胞外或内体蛋白酶可能消化 TVV 衣壳，释放病毒基因组，进而与 TLR3 相互作用改变免疫炎症反应。
3.3.3. 包装在 T. vaginalis 小细胞外囊泡（sEVs）中的 TVV 介导宿主 - 寄生虫通讯
阴道毛滴虫是一种细胞外寄生虫，TVV 感染是否改变其释放的 sEVs 成分，或 TVV 是否可通过 sEVs 转移到宿主细胞引发免疫反应，尚待研究。早期研究认为 sEVs 不含病毒 dsRNA，但近年来有研究发现 TVV 可通过 sEVs 释放，对滴虫病和炎症相关疾病的发展至关重要。TVV 感染显著影响 sEVs 的蛋白质组和 RNA cargo，TVV 阳性菌株的 sEVs 含有更多独特蛋白质，小调节 tsRNA 含量增加，且可诱导更高的促炎反应。然而，TVV 阳性寄生虫分泌的 sEVs 在某些细胞中表现出免疫抑制现象，与 TVV 阴性寄生虫分泌的 sEVs 作用相反，且当 TVV 被治愈时，这种免疫抑制作用可逆转。目前对 TVV 感染调节宿主免疫反应的研究仍处于早期阶段，TVV 的类型也尚未明确界定。
4. 蓝氏贾第鞭毛虫
4.1. 贾第虫病毒与贾第虫 EVs 的相关性
蓝氏贾第鞭毛虫（G. duodenalis）是一种鞭毛原生动物寄生虫，寄生于人类和许多其他哺乳动物的小肠，在发展中国家患病率为 20 - 30%，在发达国家为 3 - 7%，全球每年有超过 2.5 亿感染病例。贾第虫感染是低收入和中等收入国家儿童营养不良和生长迟缓的主要原因，感染患者会出现严重的胃肠道紊乱和免疫反应。
贾第虫病毒（GLV）是 Totiviridae 科的原生动物病毒，于 38 年前在 G. lamblia Portland I 株中首次被鉴定。GLV 为非包膜二十面体病毒，直径 36nm，基因组为约 6.2kb 的非分段 dsRNA，含有两个开放阅读框（ORF），分别编码衣壳蛋白（CP）和 RNA 依赖的 RNA 聚合酶。CP 负责感染宿主并抢夺宿主的帽 RNA 结构，其翻译依赖内部核糖体进入位点（IRES），通过不依赖帽的机制进行。研究发现不同 GLV 菌株具有不同的细胞内定位和毒力表型，分析其结构有助于设计增强对蓝氏贾第鞭毛虫致病作用的策略。GLV 可有效在细胞外传播，感染多种蓝氏贾第鞭毛虫分离株，低滴度感染对 G. lamblia 生长影响不大，但高滴度感染可能导致其生长停止或出现 “假死亡” 现象，具体机制尚待进一步研究。
4.1.2. 贾第虫 EVs 与 GLV 的联系
蓝氏贾第鞭毛虫的内膜系统简单，缺乏内体 / 溶酶体系统、高尔基体、过氧化物酶体和线粒体，但具有独特的外周泡（PVs），可同时发挥内体和溶酶体的功能。此外，贾第虫的包囊分泌泡（ESVs）类似于高尔基体，控制包囊壁成分的释放。虽然贾第虫缺乏高尔基体，但它能够释放微泡（MVs）和类似外泌体的囊泡（EVs）。贾第虫通过膜内陷形成 PVs，再经内体分选转运复合体形成 MVBs，最终释放 EVs。其 EVs 的产生和释放依赖于 ESCRT 相关蛋白 Vps4a、Rab 11 和神经酰胺等。
研究发现 GLV 与 Totiviridae 科的 toti - 样病毒在进化上接近，且都能通过细胞外阶段传播病毒。已有研究表明 LRV 和 TVV 可通过 EVs 传播，因此推测 GLV 也可能具有类似的传播机制。研究发现 GLV 病毒粒子常与 MVs 紧密相关，目前正在研究 GLV 是否存在于 EVs 中以及这些囊泡是否可携带 GLV 在贾第虫物种间传播，这对深入了解 GLV 的毒力至关重要。
4.2. 贾第虫 EVs 和贾第虫病毒在细胞间通讯中的作用
贾第虫分泌的 EVs 可干扰宿主 - 病原体反应。例如，贾第虫分泌的 MVs 可增加滋养体对 Caco - 2 细胞的附着，EVs 可被细胞捕获，激活和刺激人类树突状细胞。此外，贾第虫 EVs 还可调节肠道细菌的行为，如触发肠杆菌的致病特征，调节细菌的游泳运动和生物膜形成，其中小 RNA 起重要作用。同时，贾第虫 EVs 可减轻小鼠结肠炎，调节宿主免疫反应，激活多种信号通路，诱导炎症细胞因子的分泌。不同贾第虫组合分泌的类似外泌体的囊泡可传递多种 RNA，用于寄生虫间的通讯和调节。
4.2.2. GLV 对宿主免疫反应的潜在影响
目前对 GLV 感染调节宿主免疫反应的研究较少。有研究发现 TLR - 9 的激活在介导对含 GLV 或不含 GLV 的贾第虫滋养体的防御中起关键作用，含 GLV 的贾第虫菌株分泌更多的 TNF - α、IL - 6 和 IL - 12p40，但 TLR9 依赖的信号通路在含 GL<目前对 glv 感染调节宿主免疫反应的研究较少。有研究发现 tlr - 9 的激活在介导对含 glv 或不含 glv 的贾第虫滋养体的防御中起关键作用，含 glv 的贾第虫菌株分泌更多的 tnf - α、il - 6 和 il - 12p40，但 tlr9 依赖的信号通路在含 glv 和不含 glv 的情况下无显著差异，这似乎证实了 tlr9 更倾向于识别 dna 而非 dsrna。另外有综述提到 glv 的 dsrna 可被 tlr3 识别，加重宿主炎症反应，含 glv 的滋养体在小鼠巨噬细胞中可分泌更多细胞因子。然而，这些研究结果还不足以充分证明 glv>
5. 原生动物 EVs 和内共生原生动物病毒：未来应用
原生动物 EVs 在寄生虫生物学过程和宿主 - 病原体相互作用中发挥着重要作用，有望成为疾病的生物标志物，用于诊断和预后。例如，慢性恰加斯病患者血液中的原生动物 EVs 含有克氏锥虫抗原。此外，EVs 还可作为疫苗，能更有效地引发 T 细胞反应，如弓形虫和蓝氏贾第鞭毛虫的 EVs。原生动物 EVs 参与寄生虫通讯、宿主 - 病原体相互作用以及调节宿主免疫反应，使其成为对抗原生动物疾病的优秀工具，可作为治疗剂、疫苗抗原和疾病诊断或预后的生物标志物。
内共生病毒对寄生虫的生长和致病性有显著影响。LRV1 已被探索用于预防利什曼病，用重组 LRV1 衣壳和辅助性 T 细胞 1 极化佐剂制成的疫苗可减轻 LRV1 感染的利什曼原虫引起的病理变化，调节细胞介导的免疫反应，分泌 IFN - γ 对抗 LRV1 衣壳，这种新型抗内共生疫苗有潜力发展为治疗疾病的策略。病毒在细胞和细菌中的应用已在临床医学中取得成果，如噬菌体治疗细菌感染已有 100 多年历史，溶瘤病毒可用于优化癌症免疫治疗策略。
展望未来，利什曼原虫、阴道毛滴虫和蓝氏贾第鞭毛虫在全球仍广泛流行，疫苗稀缺且耐药菌株不断增加。对原生动物寄生虫模型中 EVs 的研究，以及其在宿主 - 寄生虫相互作用中的应用，有助于开发有效且经济的治疗、疫苗和药物递送平台。深入了解内共生原生动物病毒的作用，有助于设计更好的预防方案和疫苗，结合免疫疗法和化疗等其他治疗方法，利用病毒样颗粒（VLPs）进行药物递送，或操纵病毒基因组实现特定目的。
6. 结论
本文构建了一个理解寄生原生动物、EVs/exos 和原生动物内共生 dsRNA 病毒之间相互作用的框架。探讨了原生动物病毒在寄生虫中的流行情况、感染内共生病毒的寄生虫的毒力、EVs/exos 的作用，以及病毒和囊泡在哺乳动物宿主中对免疫反应的调节，展示了它们在开发限制寄生虫感染程度和严重程度的治疗策略方面的潜力。然而，目前的研究仍存在不足，例如原生动物病毒主要影响寄生虫的毒力和致病性，还是改变宿主对携带病毒寄生虫的细胞免疫反应调节，尚不明确；贾第虫病毒对寄生虫细胞外囊泡的影响也未知。未来需要进一步研究来揭示这种三方关系的复杂性。
