新一代网格蛋白终端域小分子抑制剂Pitstop 2c/2d的研发及其在抑制内吞作用和病毒入侵中的应用

本文报道了新一代网格蛋白（clathrin）终端域（TD）小分子抑制剂Pitstop 2c和2d的开发，这些化合物通过特异性阻断网格蛋白TD与内吞蛋白配体（如epsin）的结合，有效抑制网格蛋白介导的内吞作用（CME）和水泡性口炎病毒（VSV）的细胞入侵，同时展现出低细胞毒性。研究揭示了网格蛋白TD作为内吞网络核心蛋白互作枢纽的分子机制，为研究CME在细胞生理学和病原体入侵中的作用提供了新型工具。

　　研究背景与意义
网格蛋白介导的内吞作用（CME）是真核细胞主要的物质内化途径，参与受体、通道蛋白和病毒颗粒的细胞内化过程。网格蛋白终端域（TD）作为β-螺旋桨结构，通过WD40样折叠形成多个蛋白质互作位点，成为内吞网络的核心枢纽。然而，现有CME抑制剂如Pitstop 2存在核孔屏障破坏等严重副作用，开发高特异性、低毒性的抑制剂成为迫切需求。

新型抑制剂的设计与特性
研究团队基于Pitstop 2的2-氨基噻唑酮骨架，通过结构-活性关系（SAR）研究，设计合成70余种衍生物。其中Pitstop 2c和2d在苯基亚甲基位点（R1）引入苯氧基修饰，显示出<2μM的IC₅₀值，能有效竞争性抑制网格蛋白TD与amphiphysin等内吞蛋白的结合。关键优势在于：45μM浓度下处理20小时仍保持<15%细胞毒性，且不破坏核孔屏障（FITC-葡聚糖排斥实验证实）和肌动蛋白骨架。

分子机制研究
荧光成像和TIRFM动态分析显示，30μM Pitstop 2c/2d可完全阻断转铁蛋白（Tf）内吞，IC₅₀为13μM。在表达eGFP-clathrin LCa的Cos7细胞中，化合物处理使动态包被小窝（CCP）比例从42.4%降至17.9%，显著延长CCP寿命。荧光漂白恢复（FRAP）实验证实，化合物使网格蛋白在核周区域的回收率从75.5%降至37.6%，表明其通过占据TD结合位点（如blade1-2界面的R64/F91残基），阻碍epsin等衔接蛋白的置换，从而阻断CCP成熟过程。

抗病毒应用验证
在Vero-E6细胞模型中，20μM Pitstop 2c/2d预处理可显著抑制VSV入侵（p<0.01），病毒编码的GFP表达降低60%-70%。这与VSV依赖CME进入细胞的机制相符，且不影响clathrin-independent endocytosis（CIE）途径（如CD44内吞），显示出靶向特异性。

研究价值与展望
该研究突破现有CME抑制剂的毒性瓶颈，开发的Pitstop 2c/2d具有：1）明确的作用靶点（网格蛋白TD的clathrin box位点）；2）可逆性抑制特性（4小时洗脱后功能恢复）；3）潜在抗病毒应用价值。未来可拓展至其他依赖CME的病原体（如SARS-CoV-2、埃博拉病毒）入侵研究，并为解析内吞蛋白网络调控机制提供新工具。