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本文通过小鼠实验揭示环境清洁度提升会降低肠道微生物多样性，加重过敏性疾病。
一、研究背景
随着经济社会发展，人口流动日益频繁。有研究发现，从发展中国家迁至美国，人们的肠道微生物多样性会下降，且迁移时间越长，这种下降越明显。同时，慢性疾病如过敏的发生与肠道微生态失衡密切相关，迁移至发达国家会使过敏性疾病发病率上升，且迁移时间与发病率呈正相关。在人口迁移过程中，饮食、心理压力、环境清洁度和城市化等多种因素都会改变肠道菌群的组成和多样性，不过很难通过临床或流行病学调查确定关键影响因素。此前动物实验表明，低清洁度环境能增加肠道微生物多样性，但环境清洁度改善对肠道微生物结构组成和功能的影响尚不明确。本研究旨在以 C57BL/6 小鼠为模型，探究环境清洁度改善对肠道微生物组的影响。
二、材料和方法
- 实验动物分组：购买 6 周龄 C57BL/6 繁殖小鼠，在普通动物房添加土壤的垫料环境中饲养繁殖至第三代。选取 30 只 4 周龄第三代小鼠随机分为三组（每组 10 只），在该环境饲养至 8 周龄并收集粪便样本。之后，一组继续留在普通动物房（对照组），一组转移至无特定病原体（SPF）动物房（SPF 组），还有一组转移至 SPF 动物房并饲养在带粪便漏网的特制笼子里（SPFL 组），尽量防止小鼠食粪，转移后第 7 天和第 21 天再次收集粪便样本并冷冻保存。
- 皮肤致敏和血清细胞因子水平分析：小鼠 21 周龄（转移后第 13 周）时，用 2,4 - 二硝基氟苯（DNFB）反复局部处理诱导慢性炎症性皮炎。处理过程中对小鼠耳和背部皮肤病变按干燥、结痂和角化程度评分，范围为 0 - 10 分。处理结束后处死小鼠收集血液获取血清，用 ELISA 试剂盒检测血清 IgE 水平，用 LEGENDplex MU Th Panel 试剂盒检测血清细胞因子水平。
- 16S rRNA 基因测序：从粪便样本中提取微生物 DNA，扩增 16S rRNA 基因的 V4 区域，对扩增产物进行电泳、纯化和定量，然后在 Illumina MiSeq 平台进行双端测序。去除低质量和嵌合序列后，定义操作分类单元（OTUs），并确定系统发育型的分类身份。
- 鸟枪法宏基因组测序：构建宏基因组鸟枪法测序文库并测序，去除接头污染物、低质量 reads 和宿主基因组 reads，对清洁 reads 进行分类注释和丰度估计。组装 contigs，预测开放阅读框（ORFs），聚类生成独特基因集，计算基因丰度并进行功能注释。
- 数据分析和统计检验：用 QIIME 软件包分析 16S rRNA 基因的 α 多样性和 β 多样性，用 R 语言计算 β 多样性指标并进行主坐标分析（PCoA）。用 R 语言和 SPSS 进行非参数统计检验，用 R 语言的 randomForest 包进行随机森林分析。
三、研究结果
- 环境清洁度提升降低小鼠肠道微生物多样性和丰富度：通过 MiSeq 测序分析发现，环境清洁度改善前，三组小鼠肠道微生物多样性和丰度无显著差异。但改善后第 7 天和第 21 天，SPF 组和 SPFL 组的 Chao 1 丰富度估计值和观察到的 OTUs 数量均显著低于对照组，且 SPFL 组的肠道微生物多样性下降更明显，说明小鼠食粪行为有助于增加肠道微生物多样性，环境清洁度升高会使肠道微生物多样性梯度下降。
- 环境清洁度提升改变小鼠肠道微生物组成：对 16S rRNA 基因序列进行非加权 UniFrac 距离分析和 PERMANOVA 计算，发现环境清洁度改善后，三组小鼠间差异增大，两两之间的距离在环境改变前最接近，改善后距离增加。在门水平分析，SPF 和 SPFL 小鼠肠道微生物在环境清洁度改善后的变化比对照组更显著，某些小鼠中 Deferribacteres 和 Actinobacteria 的相对丰度增加。
- 环境清洁度提升导致大量肠道微生物丢失：通过 Kruskal - Wallis 检验、Mann - Whitney U 事后检验和随机森林分析，发现环境清洁度改善后，SPF 组与对照组、SPFL 组与对照组以及 SPF 组与 SPFL 组之间均有大量 OTUs 存在显著差异。在属水平分析，随着环境清洁度增加，多数差异微生物的丰度相较于对照组下降，包括具有抗过敏保护作用的 Roseburia、Muribaculum、Ruminiclostridium 和短链脂肪酸产生菌 Lachnospiraceae NK4A136 group、Lachnospiraceae UCG - 006、Butyricicoccus 等。鸟枪法测序分析也表明，环境清洁度改善使小鼠肠道微生物群中的许多物种减少，且多数差异微生物对宿主的作用尚未报道，已报道的多为机会致病菌。
- 环境清洁度提升导致肠道微生物组大量功能基因丢失：利用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库对鸟枪法序列进行功能注释，发现环境清洁度改善后，SPF 组和 SPFL 组中与氨基酸合成、维生素代谢、短链脂肪酸代谢、细菌趋化性和鞭毛组装相关的功能基因表达水平显著低于对照组，表明环境清洁度改善会使小鼠肠道微生物组的大量功能基因丢失。
- 环境清洁度提升加重 DNFB 处理小鼠的慢性炎症性皮炎：用 DNFB 处理小鼠皮肤后，SPF 组和 SPFL 组的皮肤病变比对照组更明显，且随着环境清洁度增加呈梯度变化。SPF 组和 SPFL 组小鼠血清 IgE、IL - 4、IL - 5 和 IL - 13 水平显著高于对照组，部分小鼠的 IFN - γ、IL - 2 和 IL - 6 水平也呈上升趋势。血清 IgE 水平与肠道微生物多样性呈显著负相关。
四、讨论
本研究表明，环境清洁度改善会降低小鼠肠道微生物多样性，减少大量微生物和功能基因，包括具有抗过敏保护作用和产生短链脂肪酸的细菌。同时，环境清洁度增加会使小鼠血清 IgE 和细胞因子水平升高，加重慢性炎症性皮炎。这可能解释了从发展中国家迁至发达国家的人群中过敏性疾病发病率增加的现象。环境清洁度改善对小鼠肠道微生物群的影响显著，此前对成人生活环境清洁度变化影响的研究较少，本研究填补了部分空白。此外，防止小鼠食粪会降低肠道微生物多样性，改变肠道菌群结构，说明食粪是维持小鼠肠道菌群稳定的重要因素，这一结果可能更接近人类严格粪口分离的情况。虽然本研究结果与多数研究一致，但也有研究存在差异，这可能是由于不同实验室培养的野生型小鼠肠道菌群不同。未来研究可基于本研究模型，结合代谢组学方法在蛋白质水平鉴定丢失的代谢物，通过在无菌小鼠中补充这些代谢物或相关微生物，探究其对免疫反应的精确影响，为转化研究提供思路。不过动物实验与人体研究存在差异，本研究动物数量有限，基于此对环境清洁度提升影响人类肠道微生物群和炎症症状的解释具有一定推测性，还需更多研究验证潜在机制。
