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本文聚焦细菌多糖合成机制，研究发现黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）中 EcpK 是一种细菌酪氨酸假激酶（BY pseudokinase），对胞外多糖（EPS）生物合成至关重要。它通过与多糖共聚合酶（PCP）EpsV 直接相互作用发挥功能，这一机制或广泛存在，为相关研究开辟新方向。
研究背景
细菌合成的多种多糖在生物膜形成、毒力、宿主 - 微生物相互作用等生理过程中意义重大，还广泛应用于食品、生物医学和制药行业。细菌多糖生物合成和输出主要通过 Wzx/Wzy 依赖途径、ABC 转运蛋白依赖途径和合成酶依赖途径这三种常见途径进行。
在 Wzx/Wzy 依赖途径中，多糖共聚合酶（PCP）是关键蛋白。PCP 分为 PCP - 1 和 PCP - 2 两个家族，PCP - 2 家族又包含 PCP - 2a 和 PCP - 2b 两类。PCP - 2 蛋白功能依赖于相关细菌酪氨酸激酶（BYK）的磷酸化 / 去磷酸化循环所控制的寡聚状态变化。不过，也存在一些非典型的 PCP - 2a 蛋白和独立的 BYK 结构域，它们缺乏关键催化残基。
在黄色粘球菌中，胞外多糖（EPS）对其多种生物学特性至关重要，由 Wzx/Wzy 依赖的 EPS 途径合成和输出。该途径中的 PCP - 2 蛋白 EpsV 缺乏 BYK 结构域，此前推测 MXAN_7447 可能是其独立的 BYK 伴侣。
研究结果
- Myxobacterial gene clusters for EPS biosynthesis encode a BY pseudokinase：编码 EPS 生物合成途径的基因存在于两个基因簇中，EpsV 及其同源物编码的 PCP - 2 蛋白缺乏 BYK 结构域。通过 AlphaFold2 构建 EcpK（MXAN_7447）的结构模型，并进行 Foldseek 搜索，发现 EcpK 与 BYK 结构域有相似之处，但缺乏 BYK 催化活性所需的特征基序，如 Walker A、Walker B、Walker A’ 基序以及富含酪氨酸（Tyr）的 C 末端尾巴，因此 EcpK 是一种 BY 假激酶。
- EcpK is important for EPS biosynthesis：构建 ecpK 基因的框内缺失突变体（ΔecpK），通过平板比色法检测 EPS 产生情况，发现 ΔecpK 突变体的 EPS 生物合成存在严重缺陷，在 0.5% 琼脂上的 IV 型菌毛（T4P）依赖的运动性也显著降低，与 ΔepsZ 和 ΔepsV 突变体类似。在 1.5% 琼脂上，ΔecpK 突变体的滑行运动性与野生型无明显差异。将 ecpK 基因从其天然启动子异位表达进行互补实验，可完全恢复 ΔecpK 突变体的 EPS 生物合成和 T4P 依赖的运动性，表明 EcpK 对 EPS 生物合成至关重要，是 Wzx/Wzy 依赖的 EPS 生物合成途径的重要组成部分。
- EcpK and EpsV directly interact：通过基于无标记定量（LFQ）质谱的全细胞蛋白质组学分析，发现 ΔecpK 突变体中 EpsV 无法检测到积累，ΔepsV 突变体中 EcpK 积累显著减少，且 EpsU 和 EpsY 的积累也受到影响。定量逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR）结果显示，这种相互积累依赖发生在转录后水平。细菌腺苷酸环化酶双杂交（BACTH）实验表明，EcpK 和 EpsV 之间存在直接相互作用，且 EcpK 通过与 EpsV 直接相互作用特异性激活 EPS 生物合成。
- EcpK may directly interact with the cytoplasmic base of EpsV：利用 AlphaFold - Multimer 构建 EcpK/EpsV 异源复合物模型，发现 EcpK 位于 EpsV 的细胞质基部，二者通过 EpsV 的 C 末端细胞质延伸部分相互作用，该延伸部分折叠成 EcpK 膜面向侧的凹槽，并锚定在 EcpK 的两个带负电口袋中。此外，预测 EcpK/EpsV 复合物可能形成八聚体结构，进一步支持了二者相互作用的结论。
- BY pseudokinase and PCP - 2 pairs are present in other bacteria：序列分析预测，其他粘细菌中的 EpsV 和 EcpK 同源物可能也存在类似的相互作用和功能。在新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）中，HfsAB 系统与 EcpK/EpsV 系统类似，HfsB 是 BY 假激酶，HfsA 是缺乏 BYK 结构域的 PCP - 2 蛋白，二者对固着器生物合成至关重要，且 HfsB 对 HfsA 的稳定性很重要，它们可能形成非典型的二分体 PCP - 2。
研究讨论
本研究鉴定出 EcpK 是一种 BY 假激酶，是 EPS 生物合成途径的新组分，通过与 EpsV 直接相互作用刺激 EPS 生物合成，形成非典型的二分体 PCP - 2。基于对 EcpK/EpsV 和 HfsB/HfsA 对的研究，推测存在第三类 PCP - 2 蛋白亚家族，其跨膜 / 周质部分与独立的 BY 假激酶结合发挥功能，且这类亚家族在革兰氏阴性菌的 Wzx/Wzy 依赖途径中广泛存在。
在真核生物中，Tyr 假激酶有特定的作用方式，但在黄色粘球菌中，EcpK 等 BY 假激酶似乎不依赖于与催化活性 BYK 的寡聚化或相互作用来发挥功能。研究推测，BY 假激酶如 EcpK 和 HfsB 可能作为支架，通过结合 / 解离循环引导 PCP - 2 伴侣蛋白的跨膜 / 周质部分的八聚体组装 / 解离循环，从而促进 PCP - 2 功能，且不依赖于酪氨酸磷酸化。
本研究建立了一个新的不依赖磷酸化的 PCP - 2 亚家族，为未来对 EcpK、EpsV 以及其他含有 BY 假激酶的 Wzx/Wzy 依赖多糖生物合成途径的生化和结构研究提供了框架。
材料和方法
- Strains and cell growth：本研究使用的黄色粘球菌菌株均为野生型 DK1622 的衍生物，通过两步同源重组构建框内缺失突变体，利用位点特异性重组将互补质粒整合到 Mx8 attB 位点。大肠杆菌（E. coli）用于质粒繁殖，黄色粘球菌在 1% CTT 肉汤或含相应抗生素的 1.5% 琼脂平板上 32°C 培养，大肠杆菌在 LB 肉汤中 37°C 培养。
- Plasmid construction：详细描述了用于构建 ecpK 基因框内缺失突变体、ectopically 表达 ecpK 基因以及用于 BACTH 实验的质粒构建方法，包括引物设计、片段扩增和克隆位点等。
- Detection of EPS biosynthesis：采用基于菌落的比色 EPS 检测方法，将指数生长期的细胞离心重悬后，点样在含有 Trypan blue 或 Congo red 的 0.5% 琼脂平板上，32°C 培养 24 h 后成像检测 EPS 合成情况。
- Motility assays：按照特定方法进行运动性检测，将细胞悬液点样在 0.5% 和 1.5% 琼脂平板上，32°C 培养 24 h 后，使用显微镜成像观察 T4P 依赖的运动性和滑行运动性。
- Proteomic analysis using data independent acquisition - mass spectrometry：对在固体表面生长的细胞进行全细胞蛋白质组学实验，包括细胞收获、蛋白提取、消化、肽段分离和质谱分析等步骤，使用 DIA - NN suite 和 SafeQuant 脚本分析数据，并将数据提交到 ProteomeXchange Consortium。
- RT - qPCR：培养相应菌株的细胞，提取总 RNA，经 DNase 处理后反转录生成 cDNA，使用特定引物和荧光定量 PCR 试剂盒进行 qPCR 实验，以 MXAN_3298 为内参基因，按照比较阈值循环（Ct）方法分析基因表达差异。
- Bacterial two - hybrid assay：按照制造商协议进行 BACTH 实验，将编码 ecpK 和 epsV 的 DNA 片段克隆到相应载体中，转化到大肠杆菌 BTH101 细胞中，通过观察在含有特定抗生素、X - Gal 和 IPTG 的 LB 琼脂平板上菌落的颜色变化来定性评估蛋白质 - 蛋白质相互作用。
- Bioinformatics：从 KEGG 或 UniProt 数据库获取基因和蛋白质序列，使用 MEGA - X 构建系统发育树，通过 reciprocal BLASTP hit 方法进行共线性分析。利用 AlphaFold2 和 AlphaFold2 - Multimer_v3 进行结构预测，使用 PyMOL 分析和可视化结构模型，Foldseek 用于识别蛋白质同源物，PPM 3.0 web server 预测蛋白质在膜中的定位。
- Statistical analysis：使用 Welch’s test 进行统计分析，各实验设置相应的生物学重复和技术重复，以确保实验结果的可靠性。}
