肺炎链球菌 23B 血清型研究新进展：23B1基因型的崛起与影响

肺炎链球菌 23B 血清型中 23B1基因型流行，致青霉素耐药性上升，监测意义重大。

　　

一、研究背景

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是引发呼吸道感染和脑膜炎的主要病原体之一。尽管肺炎球菌结合疫苗（PCVs）已在儿童计划中广泛应用，显著降低了侵袭性血清型的发病率，但却导致了非疫苗型（NVTs）的定植和侵袭性肺炎球菌疾病（IPD）病例的增加。其中，23B 血清型作为一种重要的非疫苗型，在全球范围内引起了关注。

23B 血清型存在不同的基因型，如原始的 23B₀和新出现的 23B₁。23B₁与 23B₀具有相同的多糖荚膜，但在 3′端的荚膜操纵子序列存在差异，属于不同的遗传谱系。在英国，随着 PCV 的使用，23B 血清型在携带菌株和 IPD 病例中的数量以及 23B₁的比例持续增加，且从社区获得性肺炎儿童中分离出的所有 23B₁菌株均对青霉素不敏感。

比利时的肺炎球菌疫苗接种政策历经多次调整，先后使用过 PCV7、PCV13 和 PCV10。在此过程中，23B 血清型在健康儿童携带菌株和 IPD 病例中的流行情况发生了变化。此前研究表明，23B 在比利时 PCV10 使用期间是健康儿童携带菌株中的主要非疫苗型，但侵袭性疾病潜力较低。然而，近年来 23B 在儿童 IPD 中的比例逐渐增加，成为重要的血清型。

二、研究方法

1. 菌株来源：在比利时肺炎球菌携带研究框架下，收集了 2016 年至 2021 - 2022 年期间 172 个日托中心（DCCs）中 6 至 30 个月大儿童的 6682 份鼻咽拭子，仅将经血清分型为 23B（荚膜肿胀反应）的肺炎球菌分离株纳入研究，共 586 株。同时，收集了 2007 年至 2021 年期间比利时全国参考中心（NRC）收到的 130 株 18 岁以下儿童 IPD 病例中经荚膜肿胀试验鉴定为 23B 血清型的分离株。
2. 全基因组测序：对所有 716 株分离株进行全基因组测序，以区分 23B₁和 23B₀。通过一系列操作，包括细菌培养、DNA 提取、文库制备和测序等，使用多种生物信息学工具进行序列分析，如确定序列类型（ST）、检测抗菌耐药基因等。
3. 最小抑菌浓度（MIC）测试：采用手动微量肉汤稀释法测定青霉素和阿莫西林的 MIC，并根据欧盟抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）非脑膜炎界值进行结果判读。同时，使用纸片扩散法对培养菌株进行其他抗生素（如复方新诺明、红霉素、四环素和左氧氟沙星）的敏感性测试。
4. 统计分析：运用卡方（χ²）检验评估 23B、23B₀、23B₁的携带率和 IPD 率以及分离株中青霉素非敏感性的显著变化。使用单因素检验评估人口统计学差异，采用曼 - 惠特尼 U 检验评估 23B₀和 23B₁分离株之间青霉素 MIC 中位数的差异。

三、研究结果

1. 携带菌株中的 23B 血清型：2016 - 2022 年期间，23B 分离株的携带率相对稳定，但在 2020 - 2021 年冬季显著增加。23B₁基因型相对于 23B₀的比例从 2016 年至 2022 年显著下降，但仍始终高于 23B₀。在 2020 - 2021 年，23B₁比例的增加与总体 23B 携带率的峰值重叠。
   • 抗生素敏感性：2016 年所有 23B 分离株中青霉素和复方新诺明的非敏感性较高，随后逐渐下降，但在 2020 - 2021 年青霉素非敏感性又显著增加，与 23B₁基因型的动态变化成比例。所有分离株对阿莫西林均敏感。23B₀和 23B₁分离株的青霉素 MIC 中位数差异显著，表明 23B₁分离株主要表现为青霉素非敏感表型。2020 - 2021 年和 2021 - 2022 年，23B 分离株中左氧氟沙星的中介敏感性增加。
   • 序列类型（ST）分布：23B₀群体中最常见的 ST 是青霉素非敏感的 ST8959，其次是青霉素敏感的 ST11655 和 ST9867。23B₁群体中最常见的 ST 是 ST2372 和 ST1349，均为青霉素非敏感。ST2372 是整个数据集中最常见的 ST，并导致了 2020 - 2021 年 23B 分离株的峰值。23B₀和 23B₁群体之间没有共享的 ST。
   • 相关因素分析：23B₀和 23B₁的流行率在比利时 DCCs 的地理分布、性别、早产、母乳喂养、鼻炎症状和肺炎球菌疫苗接种状态等方面没有显著差异。但携带 23B₁的儿童平均年龄高于携带 23B₀的儿童。近期抗生素使用对分离出青霉素非敏感菌株没有影响。
2. IPD 病例中的 23B 血清型：在 PCV7 使用期间（2007 - 2010），18 岁以下儿童中由 23B 血清型引起的 IPD 病例数量较少且稳定。2011 年后，该血清型在儿童中的流行率逐渐增加，在 2020 - 2021 年达到峰值，与携带菌株中的峰值一致。
   • 基因型变化：PCV7 期间，23B IPD 病例主要为 23B₀基因型。23B₁虽然在 2008 年就已在 IPD 中发现，但在 PCV13 首次使用期间才开始增加。2019 年后，23B IPD 病例的增加几乎完全由 23B₁基因型的增加驱动。23B₁比例的增加与青霉素和复方新诺明非敏感性的峰值相关。所有青霉素非敏感分离株要么是 23B₁分离株，要么是 ST8959 23B₀分离株，所有分离株对阿莫西林均敏感。2021 年，23B 侵袭性分离株中左氧氟沙星中介敏感性相较于之前年份有所增加，这也反映在 2021 - 2022 年的携带数据中。
   • ST 分布：2013 年后，最常见的 ST 是 ST2372，它也是 2013 年前所有 23B₁分离株中的一部分，并导致了 2021 年的峰值。
   • 其他因素分析：23B₀和 23B₁分离株在地理位置、性别、年龄类别、临床诊断和样本类型等方面没有显著差异。
3. 23B₀和 23B₁的遗传差异：23B₀和 23B₁分离株形成两个基因组上不同的进化枝，具有 11670 个核心基因组单核苷酸多态性（SNPs）。它们缺乏共享的 ST 或全球肺炎球菌测序项目聚类（GPSCs），GPSC7 在 23B₀中占主导，GPSC5 在 23B₁中占主导。在 23B₀和 23B₁各自的聚类中，核心基因组 SNPs 数量不同，进一步表明了基因型内的同质性和基因型之间的巨大基因组距离。有五个 ST1448 23B₁分离株与 23B₀分离株的关系比其他 23B₁分离株更密切，还有一些罕见的 ST 表现出与主要进化枝不同的 GPSCs。这些罕见分离株中常见耐药决定因子 ermB 和 tetM 的携带。

四、讨论

1. PCV 切换和 COVID - 19 大流行的影响：在本研究人群中，先前的抗生素治疗对 23B₁基因型或非敏感分离株的选择没有影响，抗生素治疗不是 23B₁扩张的主要驱动因素，疫苗接种和非药物干预可能是主要驱动因素。由于 23B₁基因型中青霉素非敏感性的流行，需要持续监测阿莫西林非敏感性的出现。

2008 年 23B₁基因型已在比利时人群中存在，在 PCV10 接种期间其流行率增加，在 2021 年 COVID - 19 大流行和第二次 PCV13 实施期间进一步翻倍。之后，23B 血清型在儿童 IPD 中的比例有所下降。PCV13 使用后，非 PCV10 血清型（如 19A）竞争的减少或自然变异可能导致 23B₁比例增加，从而使总体 23B 携带率上升。COVID - 19 大流行期间，COVID - 19 防护措施导致的病毒呼吸道传播减少可能也起到了一定作用。虽然日托中心在疫情期间未关闭，但其他公共卫生指南的实施影响了日托中心的社交接触，2022 年相关限制放宽后，23B 携带率略有下降。然而，由于 23B IPD 病例数量较少，难以就其种群动态以及药物和非药物干预的效果得出明确结论。

健康儿童 23B 携带率和 23B IPD 病例的共同峰值凸显了日托中心肺炎球菌血清型监测的重要性。许多国家通过监测肺炎球菌携带情况来预测 IPD 中肺炎球菌血清型的趋势，日托中心监测研究具有预测价值。2. 全球范围内 23B 血清型的上升：23B 血清型在全球范围内的无症状携带和 IPD 中受到关注，尤其是在幼儿中。欧洲 IPD 监测网络 SpIDnet 将 23B 确定为使用 PCV13 国家中的主要非疫苗型。不同国家的研究表明，随着 PCV13 的使用，23B 血清型中青霉素非敏感分离株的流行率上升，且这些增加可能是由 23B₁基因型驱动的。例如，瑞典、葡萄牙、西班牙、美国和德国等国家的研究均发现与 23B₁相关的特定 ST（如 ST2372、ST1373、ST1349）的 23B 分离株增加。而实施 PCV10 的国家，如冰岛，23B 的增加与 23B₀相关的 ST439 有关，部分实施 PCV10 的国家未报告 23B 感染的增加。因此，使用 PCV13 的国家应警惕由 23B₁基因型驱动的 NVT 23B 引起的 IPD 潜在上升。这也是将 23B 血清型纳入新的 21 价 PCV 的原因之一。

五、研究结论

2021 年，在比利时第二次实施 PCV13 和 COVID - 19 大流行期间，23B 血清型在携带菌株和 IPD 样本中的流行峰值与 23B₁型比例的上升以及青霉素非敏感性的增加相吻合。在欧洲和国际研究中，非疫苗型 23B 被认为是重要的儿科血清型，基于 ST 分析，该血清型内的扩张很可能是由 23B₁基因型驱动的。这一系列研究结果为肺炎球菌疾病的防控和疫苗研发提供了重要依据，持续监测 23B 血清型及其基因型的流行情况对于制定有效的防控策略至关重要。