探秘猪流行性腹泻病毒毒力进化密码：S 蛋白特定基序改变的关键作用

猪流行性腹泻病毒（PEDV）严重影响养猪业，自 2010 年高毒力 GII 亚型毒株出现后造成巨大经济损失。本文通过构建重组毒株，发现 GII 毒株 S 蛋白的57ENQGVNST64和722SSTF725基序参与毒力进化，为疫苗研发提供靶点，值得一读。

　　### 引言
猪流行性腹泻病毒（PEDV）严重威胁全球养猪业，其变异和致病机制尚未完全明晰。PEDV 属于冠状病毒科，基因组编码多种蛋白，其中 S 蛋白在病毒变异、致病性等方面至关重要。病毒蛋白的翻译后修饰（PTMs）影响其免疫逃逸和致病性，糖基化作为一种重要修饰，对病毒蛋白功能影响显著，但 PEDV 蛋白修饰的作用却鲜为人知。

PEDV 分为 GI 和 GII 两组，GI 又分 GI-a、GI-b，GII 分 GII-a、GII-b、GII-c。2010 年前，GI 组 PED 仅零星爆发，2010 年后，GII 组高毒力变异株全球传播，造成重大经济损失。研究聚焦于 S 蛋白糖基化位点变化对 PEDV 从 GI 到 GII 亚型毒力进化的影响，发现 GII 亚型毒株 S 蛋白有 5 个 N - 糖基化位点（aa 62、aa 116、aa 131、aa 233、aa 722）与 GI 亚型不同，旨在探究这些位点变化是否是 PEDV 毒株毒力减弱机制的一部分。

结果

1. S 蛋白突变位点：对比 rCH/SX/2015（减毒株）和 rCH/SX/2016 - S_HNXP（强毒株）基因组，预测 S 蛋白 N - 糖基化位点，发现 rPEDV - S_wt（即 rCH/SX/2016 - S_HNXP）与 rCH/SX2015 的 S 蛋白在 aa 62、aa 116、aa 131、aa 233、aa 722 处糖基化基序不同。分析 395 株 PEDV 的 S 蛋白，这些基序主要存在于 2010 年前流行的 GI 毒株和 2010 年出现的 GII - c 毒株中，在 2010 年后出现的高毒力 GII（GII - a 和 GII - b）毒株中较少或不存在，表明其在 PEDV 从 GI 到 GII 亚型转变中可能起关键作用。
2. 糖基化位点鉴定：将全长 S 蛋白及突变体转染 HEK - 293T 细胞，通过 7% Tris - 乙酸凝胶电泳检测表达和迁移率，发现全长 S 蛋白及其突变体均有表达且迁移率无差异。构建表达 D0 和 SD2 结构域及其突变体的质粒转染细胞，经 PNGase F 处理后，对比迁移率变化，证实预测位点在 D0 和 SD2 结构域表达时发生糖基化。
3. 重组菌株的体外特性：以 rPEDV - S_wt为基础构建一系列重组菌株，免疫荧光测定（IFA）和 Sanger 测序显示 rPEDV - S_mut62、rPEDV - S_mut118、rPEDV - S_mut131、rPEDV - S_mut722成功拯救，rPEDV - S_mut235未成功。在 VERO 细胞中感染重组菌株，监测多步生长动力学和噬菌斑表型，发现 rPEDV - S_mut62、rPEDV - S_mut118、rPEDV - S_mut722在不同时间点病毒滴度与 rPEDV - S_wt有差异，rPEDV - S_mut62形成较小噬菌斑。
4. 重组菌株对仔猪毒力减弱：37 只新生仔猪分组，分别口服接种 rPEDV - S_wt或重组菌株。rPEDV - S_wt组仔猪严重腹泻并全部死亡，重组菌株组虽腹泻率均为 100%，但腹泻程度较轻，死亡时间延迟，病毒粪便排毒量也较低。免疫组化（IHC）和苏木精 - 伊红（H&E）染色显示，重组菌株对肠道绒毛损伤较轻，rPEDV - S_mut62和 rPEDV - S_mut722毒力在新生仔猪中轻度减弱。
5. rPEDV - S_mut62和 rPEDV - S_mut722菌株保护猪免受野生型病毒攻击：21 dpi 时，剩余仔猪用 rPEDV - S_wt强毒株攻毒。mock - challenged 组仔猪严重腹泻，rPEDV - S_mut62和 rPEDV - S_mut722组仔猪无腹泻症状，病毒排毒量显著降低，肠道组织损伤小，表明这两种菌株能保护猪免受野生型病毒攻击。
6. rPEDV - S_mut62和 rPEDV - S_mut722菌株诱导高水平抗体：收集感染仔猪血清、咽喉和粪便拭子，检测抗体水平。rPEDV - S_mut62和 rPEDV - S_mut722组仔猪血清中抗 PEDV N IgG、抗 PEDV S IgA 和病毒中和抗体水平显著高于 mock 组，且能诱导高水平分泌型免疫球蛋白 A（SIgA），具有交叉保护作用。
7. 重组菌株遗传稳定性：重组菌株在 VERO 细胞中连续传代 10 代，测定 P5 - P10 代全基因组序列，同时对感染仔猪直肠拭子测序。结果显示，除个别非关键位点突变外，重组菌株在细胞培养和猪体内传代时，相应突变基序未发生回复突变，遗传稳定性良好。
8. S 蛋白结构改变：利用 AlphaFold 3 构建重组病毒三聚体 S 蛋白结构，Ramachandran 图表明预测结构可靠。PyMOL 叠加结构发现，rPEDV - S_mut62和 rPEDV - S_mut722的 S 蛋白与 rPEDV - S_wt的 S 蛋白相比，整体重叠良好，但在突变位点附近结构和氢键相互作用发生显著变化，这些变化可能影响病毒性能。

讨论

PEDV 仍是养猪业的重大难题，现有疫苗无法完全抵御新出现的强毒株，主要原因是 S 蛋白高度变异。研究证实 GII 毒株 S 蛋白 5 个预测 N - 糖基化基序变化，表达 D0 和 SD2 结构域确认部分基序糖基化，但全长 S 蛋白单个位点修饰对迁移率影响不明显。

S 蛋白 D0 结构域影响病毒复制和免疫反应，rPEDV - S_mut62突变可能改变 S 蛋白三聚体结构，影响其与唾液酸结合，导致毒力减弱但免疫原性良好，⁵⁷NSSS⁶⁰基序可能是中和表位 D0 的重要区域。rPEDV - S_mut722突变位点在 SD2 亚结构域，影响与周围氨基酸相互作用，可能改变受体结合结构域（RBD）构象，进而影响毒力，建立了 SD2 与 PEDV 毒力的关联。

rPEDV - S_mut62和 rPEDV - S_mut722能诱导高水平 SIgA，触发全身黏膜免疫反应，有望成为活疫苗候选株。除已发现的毒力因子，PEDV 还有许多未知毒力因素。通过反向遗传系统改变多个毒力因子，可能获得高度减毒且能诱导中和抗体的病毒，用于控制 PEDV 感染。

综上所述，本研究揭示 rPEDV - S_mut62和 rPEDV - S_mut722轻度减毒并诱导仔猪交叉保护，GII 毒株 S 蛋白的⁵⁷ENQGVNST⁶⁴和⁷²²SSTF⁷²⁵基序在 PEDV 毒力进化中起重要作用，可作为活疫苗设计的重要靶点。

材料和方法

1. 细胞和病毒：VERO 细胞在含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的杜氏改良 Eagle 培养基中培养。PEDV 多株病毒及重组菌株保存于实验室，在 VERO 细胞中进行病毒增殖。
2. 蛋白质免疫印迹法（Western blotting）：将表达全长和截断 S 蛋白及突变体的质粒转染 HEK - 293T 细胞，裂解细胞收集蛋白，部分蛋白经 PNGase F 处理，分别进行 7% Tris - 乙酸凝胶电泳或 12% SDS - PAGE 分离，转膜后用 PEDV S 单克隆抗体等进行检测。
3. 构建和拯救嵌合全长 PEDV cDNA 克隆：参考已有方法构建并拯救 rPEDV - S_mut62、rPEDV - S_mut118、rPEDV - S_mut131、rPEDV - S_mut235、rPEDV - S_mut722菌株，将重组 BAC 质粒转染 VERO 细胞，观察细胞病变效应（CPE），收集细胞和上清进行传代。
4. 重组菌株鉴定：用 VERO 细胞传代和扩增重组菌株，提取 RNA 反转录，扩增片段测序鉴定。对粪便中的重组 PEDV 菌株也用相同方法鉴定。
5. 间接免疫荧光测定（IFA）：VERO 细胞感染重组病毒 36 h 后，经固定、通透、封闭处理，依次用小鼠抗 N 单克隆抗体、荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的山羊抗小鼠 IgG（H + L）二抗孵育，DAPI 染色后用荧光显微镜观察。
6. 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real - time RT - qPCR）：提取粪便拭子 RNA 反转录，用特定引物和探针测定 cDNA 含量，检测病毒 RNA 水平。
7. 生长动力学：VERO 细胞以 MOI 为 0.1 感染重组病毒，1 h 后洗涤，在含胰蛋白酶的维持培养基中培养，不同时间点收集细胞上清，用 TCID₅₀法测定病毒滴度。
8. 噬菌斑测定：VERO 细胞接种 10 倍系列稀释的重组 PEDV，1 h 后洗涤，覆盖含胰蛋白酶的低熔点琼脂糖，培养 4 d 后用中性红染色，ImageJ 软件测量噬菌斑大小。
9. 重组菌株致病性评估：37 只新生仔猪分组，实验组口服接种重组菌株，mock 组接种 DMEM，监测临床症状、腹泻评分、直肠拭子病毒水平，计算存活率，对死亡或安乐死仔猪肠道组织进行 H&E 和 IHC 染色。
10. 重组菌株免疫原性评估：感染 21 d 后收集存活仔猪血液样本，再用亲本菌株 rPEDV - S_wt攻毒，监测临床症状、死亡率，收集直肠和咽喉拭子及血液样本，对 9 dpc 安乐死仔猪肠道组织进行 H&E 和 IHC 染色。
11. ELISA 检测血清、粪便和唾液样本中的抗 PEDV N IgG 和 S IgA：在 21 dpi/0 dpc 和 28 dpi/7 dpc 收集血清样本，用相应 ELISA 试剂盒检测抗 PEDV N IgG 和 S IgA 水平。处理直肠和唾液拭子样本后，用试剂盒检测 SIgA 水平。
12. 病毒中和试验：热灭活血清 4 倍系列稀释，与含 200 TCID₅₀ PEDV 的病毒混合物 37°C 孵育 90 min，接种 VERO 细胞，培养 4 d 后用 Reed 和 Muench 法计算中和抗体效价。
13. 蛋白质结构预测：用 NetNGlyc 1.0 服务器预测 N - 糖基化位点，将 PEDV S_wt、S_mut62和 S_mut722序列提交至 AlphaFold 3 服务器预测 S 蛋白三聚体结构，用 PyMOL 2.3.0 进行结构分析和可视化。
14. 统计分析：使用 GraphPad Prism 8.0.2 进行统计分析，采用未配对 t 检验，*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001 为差异有统计学意义，误差线表示均值 ± 标准差。