低温环境下乳酸菌特性对青贮品质的影响：挖掘提升青贮质量的新路径

本文聚焦低温青贮难题，从天然发酵青贮中筛选耐低温乳酸菌（LAB）。研究发现，添加戊糖片球菌（Pediococcus acidilactici）可调节微生物代谢通路和群落组成，提升低温青贮品质，为北方寒冷地区青贮质量改善提供关键参考。

　　### 低温青贮研究背景
天然草原牧草资源丰富，但季节性强、营养价值中等偏低，在北方地区冬季和春季难以满足牲畜饲料需求。青贮技术是保存牧草营养的有效方式，通过乳酸菌（LAB）发酵，将可溶性碳水化合物转化为有机酸，降低 pH 值，抑制有害微生物生长，从而保存牧草中的营养成分。然而，在北方低温环境下，青贮发酵面临挑战，LAB 活性不足，发酵缓慢，商业 LAB 接种剂效果不佳，因此筛选耐低温 LAB 菌株至关重要。

材料与方法

1. 乳酸菌菌株筛选：采集内蒙古高原草甸草原的天然牧草，经稀释涂布在 MRS 琼脂培养基上，厌氧培养后分离 LAB 菌株。通过测定生长曲线、产酸曲线、葡萄糖产气情况、温度和糖耐受性，筛选出一株生长快、产酸强的菌株 L10，经 16S rRNA 测序鉴定为戊糖片球菌（Pediococcus acidilactici）。
2. 青贮制备：在内蒙古呼伦贝尔草甸草原采集乳熟期天然牧草，切碎后添加戊糖片球菌（L10），浓度为 10⁵ cfu/g 鲜重（FM），分别在室温（25°C，CK）、15°C（MT）和 5°C（LT）下密封发酵 60 天，每个处理设置 3 次重复。
3. 分析指标与方法：测定青贮的化学组成，包括干物质（DM）、粗蛋白（CP）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、水溶性碳水化合物（WSC）、乙醚提取物（EE）等；测定发酵参数，如 pH 值、氨氮（NH₃-N）、有机酸（乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸（PA）、丁酸（BA））含量；评估微生物数量，包括 LAB、酵母、霉菌、厌氧细菌和大肠杆菌；采用高通量测序分析细菌群落结构；运用代谢组学技术分析代谢产物。
4. 统计分析：使用 SAS 软件进行单因素方差分析（ANOVA）和邓肯多重比较，微生物群落和代谢组数据在 Majorbio 云平台分析，P < 0.05 表示差异显著。

实验结果

1. LAB 菌株特性：菌株 L10 为同型发酵细菌，能在 5°C、15°C 和室温下生长，可利用多种碳水化合物，16S rRNA 测序显示其与戊糖片球菌相似度达 100%。
2. 新鲜材料特性：青贮前，天然牧草 DM 含量为 34.63%，CP 含量为 16.01%，WSC 含量为 3.68% DM，pH 值为 6.16，附生乳酸菌数量为 3.08 lg cfu/g FM。
3. 青贮温度对营养成分、发酵品质和微生物数量的影响：温度显著影响青贮的 DM、pH 值、LA 含量和 LAB 数量。LT 处理的 WSC 和 CP 含量显著高于 CK 处理，pH 值显著低于 CK 处理；MT 处理的 LA 含量最高。不同温度下，NDF 含量随温度降低而降低，EE 含量随温度降低而升高，NH₃-N 含量无显著差异，未检测到 BA，PA 在 MT 和 LT 处理中未检出。
4. 青贮后细菌群落多样性分析：所有样本测序覆盖度均高于 99%。CK 组的 Shannon 指数显著高于 MT 和 LT 处理，表明其微生物多样性更高。PCoA 分析显示，不同处理的细菌群落结构差异显著。在属水平上，CK 组以短乳杆菌（Levilactobacillus brevis）和植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）为主；MT 组以植物乳杆菌为主；LT 组以戊糖片球菌为主。
5. 细菌共现网络分析：低温降低了细菌网络的复杂性，LT 处理的网络结构比 CK 处理更简单，边和节点数量更少。
6. 差异代谢物分析：非靶向代谢组学分析表明，MT 和 LT 处理与 CK 处理的代谢产物存在显著差异。MT 处理与 CK 处理相比，有 311 种代谢物上调，504 种下调；LT 处理与 MT 处理相比，有 603 种代谢物上调，291 种下调。代谢通路富集分析显示，不同温度影响多种代谢通路，如类固醇激素生物合成、花生四烯酸代谢等。
7. 细菌相对丰度与代谢物的相关性：戊糖片球菌、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和融合魏斯氏菌（Weissella confusa）与 L - 脯氨酸、L - 酪氨酸、柠檬酸和 L - 色氨酸显著正相关；植物乳杆菌与左旋糖、果胶、D - 葡萄糖醛酸 1 - 磷酸和水杨酸正相关；短乳杆菌与 L - 苯丙氨酸、L - 天冬氨酸和水杨酸正相关，与 L - 脯氨酸等负相关。

讨论

1. LAB 对青贮发酵的重要性：LAB 添加剂在改善青贮饲料质量方面发挥关键作用。选择合适的 LAB 菌株并优化发酵参数，如接种量和温度，对提高青贮品质至关重要。
2. 菌株 L10 的特性及优势：戊糖片球菌（L10）能在低温和低葡萄糖浓度下生长，可利用多种碳水化合物，这可能与其在内蒙古高原寒冷地区的长期进化和自然选择有关。
3. 低温对青贮品质的影响：低温处理使青贮的 DM 含量降低，WSC 含量升高，这可能是植物代谢途径和细胞膜组成调整的结果。较低的 pH 值抑制了有害微生物和蛋白水解酶的活性，有助于保存饲料蛋白，降低 NDF 含量。
4. 微生物群落结构与发酵品质的关系：高质量青贮通常与较低的微生物 α- 多样性相关。低温不利于除 LAB 外的微生物生长，导致细菌多样性降低。不同温度下，优势菌群不同，影响青贮的发酵品质和有氧稳定性。
5. 代谢物与细菌的相互作用：低温显著改变青贮发酵过程中的代谢产物组成。代谢物的变化通过双组分系统和群体感应系统影响细菌行为和代谢，进而改变细菌群落结构。例如，水杨酸与植物乳杆菌的丰度正相关，可抑制有害微生物生长；脯氨酸具有低温保护特性，与多种细菌呈正相关。

结论

本研究成功从天然牧草中分离出耐低温、低糖的戊糖片球菌（L10）。添加该菌株的天然牧草青贮在 5°C 发酵时，WSC 和 CP 含量较高，BA 含量较低，发酵品质得到提升。5°C 条件下，戊糖片球菌成为优势菌，通过双组分信号通路影响细菌群体感应，上调柠檬酸含量，增强发酵品质。因此，在低温条件下，添加 L10 菌株可有效提高天然牧草青贮的发酵质量。